益骨颗粒对原发性骨质疏松症的治疗作用及其机制探讨

目的：对益骨颗粒治疗骨质疏松症的作用进行药效学评价,并从血钙浓度、骨形成-骨吸收的耦联状态、成骨细胞的增殖分化等方面对该治疗作用的机制进行探讨。方法：1.益骨颗粒对双侧卵巢摘除大鼠骨质疏松症的治疗作用SD雌性大鼠随机分为假手术组、模型组、雌二醇组、益骨颗粒低、中、高组。除假手术组外,其余动物双侧摘除卵巢以制备骨质疏松症模型,假手术组动物不摘除卵巢,只剪去卵巢附近约1g的脂肪。术后一周,动物分别灌胃给药,剂量分别为：雌二醇0.0003 g ·kg-1 · d-1益骨颗粒低剂量0.4g · kg-1、中剂量0.8g · kg-1 · d-1、高剂量1.6g · Kg-1 · d-1,假手术组和模型组动物给予等量蒸馏水,连续治疗16周。给药后第12、16周,分别对动物全身的骨密度进行检测。动物处死前第14天皮下注射盐酸四环素,25mg/kg；处死前第4天皮下注射钙黄素,10mg/kg以制备荧光标记。末次给药后1h,动物腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg麻醉,腹主动脉取血,分离血清,利用ELSIA法检测血清中骨钙素、抗酒石酸酸性磷酸酶5b的含量,利用全自动生化仪检测血清中钙、磷、碱性磷酸酶的含量。取血完毕,动物处死,取其子宫、腰椎、双侧股骨及左侧胫骨。子宫用于制作病理切片,观察益骨颗粒对子宫的影响；腰椎和右侧股骨用于离体骨密度检测；左侧股骨用于生物力学指标的检测；左侧胫骨用于制作切片,观察该药对骨组织形态计量学指标(骨外膜形成率等)的影响。2.益骨颗粒对大鼠成骨细胞增殖分化及其合成分泌碱性磷酸酶作用的影响取新生2日龄SD大鼠颅骨,利用酶消化,对其中的成骨细胞进行原代分离,并行形态学观察与碱性磷酸酶染色鉴定。制备雌二醇、益骨颗粒低、中、高剂量的含药血清,按体系数浓度的10%加入第三代成骨细胞培养基,继续培养48h、72h后,CCK-8法检测成骨细胞增殖状况,磷酸对硝基苯酯法检测细胞中碱性磷酸酶水平。结果：1.益骨颗粒对双侧卵巢摘除大鼠骨质疏松症的治疗作用(1)与模型组相比,给药3个月后,益骨颗粒高剂量组能显著提高动物的骨密度；给药4个月后,益骨颗粒各剂量组均能显著提高动物的骨密度值。此外,益骨颗粒中、高剂量组能显著提高股骨、腰椎的骨密度。(2)与模型组相比,益骨颗粒中剂量可显著地提高血清钙的水平。此外,益骨颗粒中、高剂量组血清的OCN、TRACP5b有显著性地降低。(3)在生物力学实验中,益骨颗粒中、高剂量组动物股骨的最大弯曲应力、最大应变、骨刚性系数较模型组有显著性地提高。(4)通过胫骨骨组织形态计量学观察发现,益骨颗粒高剂量可显著性地提高骨小梁面积百分数；而中、高剂量可降低骨小梁分离度,结果有统计学意义。此外,益骨颗粒中、高剂量可降低骨外膜荧光周长百分数,而各剂量也可显著性地降低骨外膜形成率。2.益骨颗粒对大鼠成骨细胞增殖分化及其合成分泌碱性磷酸酶作用的影响(1)与对照组相比,经益骨颗粒各剂量含药血清培养72h后,成骨细胞的增殖率有显著性的提高。(2)与对照组相比,经益骨颗粒各剂量含药血清培养48h后,成骨细胞碱性磷酸酶水平有显著性的提高。结论：大鼠双侧卵巢摘除,是制备骨质疏松模型的经典方法,该模型可出现临床上骨质疏松症的一系列特征,如钙质的流失、骨密度的下降、骨组织显微结构破坏、骨生物力学功能下降和骨代谢相关指标的变化等。基于此模型,本课题发现益骨颗粒不仅可以提高模型动物的骨密度值,对骨质疏松所引起的骨组织显微结构破坏和骨生物力学功能下降都有一定的改善作用。此外,在体外的细胞实验中,本课题发现益骨颗粒有增强成骨细胞的增殖分化的作用,并能加强成骨细胞合成分泌碱性磷酸酶的功能。联系上述,益骨颗粒对骨质疏松的治疗作用可能与其促进成骨细胞增殖分化,纠正骨吸收-骨形成失衡状态,减少骨中钙质流失；促进成骨细胞分泌合成ALP,使P与Ca沉积于骨胶原骨架上,加快骨质矿化；维持骨小梁正常形态,改善骨生物力学作用有关。