不同牵伸强度对体外人肌腱细胞PLA2/COX/PGE2分子网络调控的初步研究

肌腱病是骨科学和运动医学常见的伤病。过度载荷的循环牵伸是其发病的直接原因。病理学证实：肌腱过度、重复的牵伸使用导致了肌腱组织的炎症、退变，甚至微损伤、断裂。大量研究表明：在体外循环牵伸载荷条件下，人肌腱细胞产生前列腺素E2(PGE2)的水平明显增高，PGE2在肌腱病的炎性反应中起着重要作用。PGE2在其它疾病中主要受到PLA2/COX/PGE2分子网络系统调控。在肌腱病的发病过程中，肌腱细胞是否受到不同牵伸强度对PLA2/COX/PGE2分子系统调控，目前尚不清楚。 本课题组前期研究提示：肌腱细胞分泌的PGE2随着不同的牵伸强度增加而增加，同时肌腱细胞通过胞外机械力学信号转化为胞内生物化学信号，可能启动PLA2/COX/PGE2分子网络系统，促进PGE2的产生，引起肌腱病的形成。本研究在课题组前期研究的基础上，初步探讨不同牵伸强度对肌腱细胞增殖、凋亡和分泌型磷脂酶A2(sPLA2)、胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)、环氧合酶1(COX1)、环氧合酶2(COX2)及PGE2表达的影响，旨在明确不同牵伸强度对肌腱细胞PLA2/COX/PGE2分子网络系统的调控作用，为肌腱病的防治策略提供新线索。 本研究从如下三个方面初步分析不同牵伸强度对体外人肌腱细胞PLA2/COX/PGE2分子网络的调控作用： 1.体外人肌腱细胞培养牵伸及不同牵伸强度对细胞增殖凋亡的影响 本实验拟建立能最大限度摸拟人体内肌腱细胞牵伸受力方向的体外牵伸模型，研究不同牵伸强度对体外人肌腱细胞增殖凋亡的影响。 1.1实验方法 1.1.1人肌腱细胞的培养鉴定及单向循环牵伸 采用酶消化法培养体外人原代肌腱细胞，倒置显微镜观察细胞生长情况，激光共聚焦显微镜观察波形蛋白及I、III型胶原免疫荧光染色表达，应用本课题组前期研制的细胞牵伸器单向循环牵伸人肌腱细胞。 1.1.2实验分组 肌腱细胞种植于微沟槽培养皿贴壁生长，加载于细胞牵伸器，在0.5Hz、4h条件进行单向循环牵伸，置于细胞培养箱中牵伸培养，相同强度的牵伸组细胞共培养于成对的微沟槽培养皿，4%牵伸组、8%牵伸组及12%牵伸组设为不同牵伸强度的实验组，未牵伸组设置为对照组，牵伸结束静置4h后收集肌腱细胞及上清进行检测。 1.1.3不同牵伸强度对体外人肌腱细胞增殖凋亡的影响 应用CCK－8测定肌腱细胞增殖的情况，流式细胞仪检测细胞的凋亡及周期情况。 1.2实验结果 1.2.1人肌腱细胞的形态观察与鉴定 在倒置显微镜下观察肌腱细胞大体形状为长梭形，呈肌腱纤维样条簇状排列，折光性强；同时在激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光染色显示波形蛋白、Ⅰ型胶原呈阳性、Ⅲ型胶原呈阴性，符合肌腱细胞的表型鉴定。 1.2.2人肌腱细胞牵伸前后形态学观察 肌腱细胞种植于微沟槽培养皿，4h后部分细胞开始贴壁，12h后95%细胞贴壁，沿着皿底呈多向不规则排列。在0.5Hz、4h条件下进行单向循环牵伸，牵伸结束后在倒置显微镜下观察，肌腱细胞多沿皿底沟槽牵伸应力方向排列，无细胞脱落。 1.2.3CCK－8检测不同牵伸强度对肌腱细胞增殖的影响 4%、8%、12%牵伸组OD值与对照组相比明显降低，有显著性统计学意义(P﹤0.05)。 1.2.4流式细胞仪检测不同牵伸强度对肌腱细胞周期及凋亡的影响 实验组与对照组相比较，G1/S期百分比无显著性差异，凋亡率与对照组相比有显著性统计学意义(P﹤0.05)，随着牵伸强度的增加，凋亡率逐渐增加，以8%牵伸组及12%牵伸组上升明显。 1.3小结 1.3.1酶消化法成功分离培养人肌腱原代细胞，通过免疫表型观察符合肌腱细胞的鉴定，为本实验提供了充足的肌腱细胞。 1.3.2肌腱细胞种植于微沟槽培养皿，加载于细胞牵伸器单向循环牵伸，能最大限度摸拟体内肌腱细胞平行单向受力牵伸环境。 1.3.3在0.5Hz，4h条件下，肌腱细胞进行4%、8%、12%不同强度的牵伸，牵伸强度影响肌腱细胞的增殖能力，增殖率随着牵伸强度的增加而下降，凋亡率随牵伸强度的增加而上升，但对肌腱细胞G1/S期无影响。 2.不同牵伸强度对体外人肌腱细胞PLA2/COX表达的影响 本部分在第一部分建立体外人肌腱细胞的牵伸模型基础上，从基因水平和蛋白水平两个方面，研究不同牵伸强度对人肌腱细胞cPLA2、sPLA2、COX1、COX2的表达变化趋势。 2.1实验方法 2.1.1利用western blot测定cPLA2、COX1及COX2蛋白表达差异 加入兔抗人cPLA2、COX1、COX2一抗及HRP标记的二抗。图像密度测定仪测定各目的蛋白印迹表达与内参β-actin灰度值，相对灰度值分析各蛋白表达存在的差异趋势。 2.1.2利用RT-PCR分析cPLA2、COX1及COX2基因转录差异，凝胶成像仪扫描，Quantity one软件测定目的条带及内参灰度值，计算相对灰度值分析各基因转录的差异。 2.1.3利用ELISA测定sPLA2的分泌量，分析不同牵伸强度下sPLA2胞外分泌的变化趋势。 2.2实验结果 2.2.1RT-PCR检测体外人肌腱细胞在不同牵伸强度下cPLA2、COX1及COX2基因的转录 在4%、8%、12%三种不同的牵伸强度下(0.5Hz,4h)与对照组相比，cPLA2、COX1及COX2基因的转录差异均有显著性统计学意义(P<0.05)。 2.2.2Western blot检测体外人肌腱细胞在不同牵伸强度下cPLA2、COX1及COX2蛋白的表达 cPLA2、COX1在4%牵伸强度下，与对照组相比无显著性统计学差异（P＝0.135, P＝0.387），在8%及12%牵伸组表达呈上升趋势，相对于对照组有显著性统计学差异(P﹤0.01)。COX2随着4%、8%及12%牵伸强度的上升，蛋白条带表达的灰度值逐渐递增，均相对于对照组有显著性统计学差异(P﹤0.01)。 2.2.3ELISA检测不同牵伸强度对体外人肌腱细胞胞外的sPLA2分泌影响 随着4%、8%、12%等不同牵伸强度递增，sPLA2分泌量增加，以8%牵伸强度和12%牵伸强度上升明显。4%、8%牵伸组sPLA2分泌量为对照组的1.12、1.8倍，12%牵伸组sPLA2分泌量上升到2.37倍。sPLA2分泌量在8%和12%牵伸组上升明显，相对于对照组有显著统计学差异(P﹤0.01)，而在4%牵伸组无显著统计学差异(P＝0.260)。 2.3小结 在0.5Hz、4h等4%、8%、12%不同牵伸强度下，从基因水平和蛋白水平两个方面证实了不同牵伸强度对体外人肌腱细胞PLA2/COX表达的影响，尤其8%及12%牵伸强度对PLA2/COX具有较为明显的上调作用。 3.AACOCF3对体外人肌腱细胞增殖凋亡及PGE2分泌的作用研究 本部分以实验第二部分PLA2/COX/PGE2分子网络的研究结果为基础，研究cPLA2特异性抑制剂AACOCF3对肌腱细胞周期、增殖、凋亡及PLA2下游产物PGE2的影响。 3.1实验方法 3.1.1利用Western blot检测不同浓度梯度的AACOCF3在12%牵伸强度cPLA2的蛋白表达 肌腱细胞种植于微沟槽培养皿，加入0.1μM、1μM、10μM浓度的AACOCF3试剂，未加AACOCF3试剂设为对照组，在0.5Hz、4h分别以12%强度进行牵伸，牵伸结束后收集细胞进行Western blot实验，根据AACOCF3各浓度梯度决定抑制cPLA2的最适AACOCF3浓度，用于下一步试验。以12%牵伸强度加载于细胞牵伸器进行0.5h、4h牵伸，加入最适浓度的AACOCF3剌激组设为实验组，未加入AACOCF3剌激组设为对照组，牵伸结束后收集肌腱细胞及上清，用于如下实验。 3.1.2采用CCK－8检测12%伸强度下最适AACOCF3浓度刺激对肌腱细胞增殖的影响 实验方法同实验第一部分。 3.1.3采用流式细胞仪检测12%牵伸强度下最适AACOCF3浓度刺激对肌腱细胞周期和凋亡的影响 实验方法同实验第一部分。 3.1.4采用ELISA检测上12%牵伸强度下最适AACOCF3浓度刺激对肌腱细胞液中PGE2的分泌的影响 实验方法参照sPLA2的ELISA试剂盒说明书进行。 3.2实验结果 3.2.1不同AACOCF3浓度刺激下肌腱细胞内cPLA2的蛋白表达 0.1μM浓度AACOCF3对cPLA2的蛋白表达抑制作用较弱，而1μM、10μM浓度AACOCF3对cPLA2的蛋白表达抑制作用较强，尤以10μM浓度较为明显，因此选择10μM浓度的AACOCF3作为抑制cPLA2的最适浓度进行下一步试验。 3.2.2CCK－8检测最适AACOCF3对12%牵伸强度下肌腱细胞增殖 实验组与对照组比较，OD值均明显增加。从增殖曲线来看，10μM浓度为AACOCF3有利于促进肌腱细胞增殖。 3.2.3流式细胞仪检测最适检测AACOCF3对12%牵伸强度组肌腱细胞周期 实验组凋亡峰明显下降，与对照组相比均有显著差异（P<0.05），肌腱细胞G1/S期无显著性差异（P=0.427）。 3.2.4ELISA检测最适AACOCF3对12%牵伸强度组肌腱细胞PGE2的分泌 实验组PGE2的分泌量与对照组比较，肌腱细胞分泌的PGE2明显增加，有显著性统计学差异（P<0.05）。 3.3小结 3.3.1在12%牵伸强度下，0.1μM浓度AACOCF3对cPLA2的蛋白表达抑制作用较弱，1μM、10μM浓度AACOCF3对cPLA2的蛋白表达抑制作用较强，尤以10μM浓度较为明显。 3.3.2在12%牵伸强度下，10μM浓度的AACOCF3有利于促进人肌腱细胞增殖，凋亡率明显下降，对细胞周期无明显影响。 3.3.3在12%牵伸强度下，10μM浓度的AACOCF3刺激人肌腱细胞PGE2的分泌减少，与细胞的增殖及凋亡有关。