基于ROS-MAPK/NLRP3-IL-1β信号通路研究半夏、掌叶半夏致炎毒性机制及生姜解毒机理

半夏和掌叶半夏均为天南星科有毒中药,接触或误服生品或鲜品后均出现强烈的刺激性毒性,引起口舌肿胀、咽喉肿痛、皮肤刺激等,限制其临床应用。课题组前期研究发现,半夏和掌叶半夏含有共性的毒性物质:特殊晶型的毒针晶及毒针晶中含有的凝集素蛋白。凝集素蛋白可加重毒针晶的炎症刺激性毒性;半夏凝集素蛋白(Pinellia ternata lectin,PTL)和掌叶半夏凝集素蛋白(Pinellia pedatisecta lectin,PPL)能够刺激巨噬细胞过量生成ROS和诱导IL-1β、TNF-α等炎症因子的释放,能够导致严重的炎症反应,但致炎机制还有待进一步研究。历代本草记载,如《肘后备急方》:“中半夏毒以生姜汁、干姜并解之”,生姜能够解天南星科有毒中药的毒性。生姜为姜科植物姜(Zingiber officinale Roscoe)的新鲜根茎。研究发现,生姜中姜辣素类成分是生姜抗炎的有效成分,能够抑制PTL和PPL刺激巨噬细胞诱导的ROS的过量生成和IL-1β、TNF-α炎症因子的大量释放,但其抗炎的机制不明。有研究报道,ROS被认为具有第二信使的作用,不仅是MAPK信号通路的上游信号分子,还是调控炎性小体活化的关键信号。为了进一步揭示半夏凝集素蛋白和掌叶半夏凝集素蛋白致炎作用的机制。本论文从细胞和分子水平研究PTL和PPL引起的炎症毒性与MAPK信号通路以及炎性小体NLRP3信号通路的相关性,为临床天南星科有毒中药的饮片生产、临床合理应用提供依据;同时研究生姜中姜辣素类成分拮抗PTL和PPL诱导炎症的作用机理,阐释传统中药理论现代科学内涵。主要实验内容和结果总结如下:1.PTL和PPL刺激巨噬细胞诱导炎症的作用及机制研究采用DCFH-DA荧光探针和Elisa法研究PTL和PPL刺激巨噬细胞对胞内ROS生成和IL-1β释放的影响。实验结果表明,PTL和PPL(6.25、12.5、25、50μg/mL)刺激巨噬细胞能够引起剧烈的氧化应激反应,促使胞内活性氧ROS大量的生成及炎症因子IL-1β的大量释放,且呈明显的剂量依赖性。研究同时发现,PTL和PPL(6.25、12.5、25、50 μg/mL)刺激巨噬细胞可促进pro-IL-1β的生成。文献研究发现,pro-IL-1β的生成与MAPK信号通路相关。Western-blot实验结果显示,PTL和PPL刺激巨噬细胞可促使p38、JNK和ERK磷酸化水平升高。表明PTL和PPL能够激活MAPK信号通路,促使了pro-IL-1β 的生成。依据文献,IL-lβ的成熟依赖于caspase-1的剪切作用。采用Ac-YVAD-cmk预处理0.5h再加入凝集素蛋白(50μg/mL)的方法,进一步考察caspase-1的活化对于IL-1β成熟的关键作用。Westem-blot实验结果表明,Ac-YVAD-cmk能够抑制IL-1β生成。表明IL-1β的成熟依赖于caspase-1的活化。同时,Western-blot法检测到PTL、PPL均可促使巨噬细胞中NLRP3、ASC、caspase-1 p20表达水平升高,TXNIP表达水平降低,且呈显著的剂量依赖性。说明PTL和PPL均能够激活NLRP3炎症小体信号通路中相关蛋白的表达,促进caspase-1的活化。采用免疫共沉淀的方法检测TRX、TXNIP与NLRP3的相互作用。结果显示,两种凝集素蛋白刺激巨噬细胞后,能够促进TXNIP与TRX解离,TRX与NLRP3进一步相结合。采用荧光共定位技术检测caspase-1、ASC与NLRP3的相互作用。结果显示,两种凝集素蛋白能够促进ASC、caspase-1、NLRP3三种蛋白的相互结合,促进炎性小体的组装形成,结合caspase-1 p20及IL-1β水平升高的结果,进一步证明两种凝集素蛋白均可激活NLRP3炎症小体信号通路,从而促进炎症因子IL-1β水平升高,促进了炎症的发展。2.活性氧ROS与PTL和PPL诱导炎症作用的相关性研究采用ROS特异性抑制剂NAC(0.1、0.5、2.5、12.5mM)预处理0.5h再加入凝集素蛋白(50 μg/mL)的方法,进一步考察凝集素蛋白的致炎作用与活性氧ROS的相关性。结果显示,NAC能够抑制凝集素蛋白诱导的ROS和IL-1β的大量生成。同时检测到加入NAC抑制ROS释放降低后,PTL、PPL导致的p38、JNK和ERK磷酸化水平升高被抑制;caspase-1 p20表达降低,TXNIP表达水平升高。研究结果表明,NAC能够抑制PTL和PPL对于MAPK信号通路及NLRP3炎症小体信号通路的激活作用。上述结果表明,ROS是PTL和PPL诱导炎症反应的关键信号分子。PTL和PPL能够激活ROS-MAPK/NLRP3-IL-1β信号通路。3.生姜抗炎有效部位的筛选以及姜辣素类成分对于PTL和PPL诱导炎症的拮抗作用研究生姜经乙酸乙酯回流提取除去挥发油后得乙酸乙酯提取部位,另提取分离得挥发油及药渣水提取部位。这三个提取部位对凝集素蛋白诱发炎症的拮抗作用研究发现,乙酸乙酯提取部位具显著的抗炎作用,挥发油及药渣水提取部位无明显抗炎效应。LC-MS MS液质联用分析发现,乙酸乙酯提取部位中,姜辣素类成分的峰占比仅为50.73%,表明乙酸乙酯提取部位中还存在较多非姜辣素类成分。为了进一步富集生姜中的姜辣素类成分,分别采用石油醚、乙酸乙酯对乙酸乙酯提取部位进行再萃取,得石油醚再萃取部位、乙酸乙酯再萃取部位和水再萃取部位。研究发现其中石油醚再萃取部位的抗炎作用最强。HPLC法分析石油醚再萃取部位中6种姜辣素类成分(包括6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、8-姜烯酚、10-姜酚和10-姜烯酚)的含量达49.14%;质谱分析发现,该部位姜辣素类成分的峰占比达到89.87%,结果表明石油醚再萃取部位主要含姜辣素类成分。上述实验表明,姜辣素类成分能够显著抑制PTL、PPL诱导的ROS的过量生成和炎症因子IL-1β的大量释放。表明,姜辣素类成分是生姜中发挥抗炎作用的主要成分。4.姜辣素类成分对PTL和PPL激活MAPK和NLRP3信号通路的拮抗作用机制研究药理实验表明,姜辣素类成分能够抑制PTL、PPL诱导的MAPK信号通路的激活,抑制NLRP3信号通路的激活,抑制caspase-1的活化,从而拮抗凝集素刺激巨噬细胞诱导的炎症。总结1.论文研究发现PTL和PPL能够导致严重的炎症反应,活性氧ROS是两种凝集素蛋白诱发炎症的关键信号分子,其诱导强烈炎症的机制在于激活ROS-MAPK/NLRP3-IL-1β信号通路,促进炎症因子IL-1β的成熟活化,从而导致炎症的进一步发展。2.生姜中姜辣素类成分是其发挥抗炎作用的有效部位,其拮抗两种凝集素蛋白炎症的作用机制是,通过阻断两种凝集素蛋白引发的氧化应激反应,抑制MAPK信号通路和NLRP3信号通路的激活,进而抑制了炎症因子IL-1β生成及释放,最终阻断凝集素蛋白引发炎症的再发展进程,阻断了炎症级联反应。