人参皂苷Rg1调控经典Wnt信号通路延缓造血干/祖细胞衰老的机制研究

目的干细胞衰老是机体衰老的关键因素和最新学说,调控干细胞衰老对探讨衰老生物学机理与防治老年性疾病尤为重要。造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）衰老特征主要表现为自我更新能力衰退及分化功能异常,其表现主要是贫血、白血病、免疫力低下、骨髓造血抑制等衰老相关性疾病。人参是中医传统的“补气”中药,人参皂苷Rg1是其主要的药物活性成分,有广泛的药理作用,具有提高记忆力、增强免疫力、抗肿瘤和促进细胞修复等作用。本课题组前期研究证明,人参皂苷Rg1具有调控造血干/祖细胞（HSC/HPCs）衰老的作用,但其分子机制尚不清楚,值得深入探讨。本研究将干细胞衰老的最新技术理论与祖国传统的抗衰老医学紧密结合,分别构建HSC/HPCs体外、体内衰老模型,研究人参皂苷Rg1延缓HSC/HPCs衰老与调控Wnt/β-catenin信号通路的关系,深入阐释Rg1延缓HSC/HPCs衰老的分子机理,对弘扬祖国传统医学的“气血理论”有重要学科价值,对寻找延缓或治疗HSC/HPCs衰老的分子作用靶点有重要意义。方法1.小鼠造血干/祖细胞的分选:免疫磁珠分选法（MACS）分离提取、纯化小鼠骨髓中Sca-1+HSC/HPCs,流式细胞术鉴定细胞表型和台盼蓝染色测细胞活力。2.氧化低密度脂蛋白（oxidation low density lipoprotein,ox-LDL）诱导Sca-1+HSC/HPCs的体外衰老模型,实验分为五组:对照组;ox-LDL衰老组;ox-LDL+Rg1组;ox-LDL+DKK1组;ox-LDL+NAC组。研究Rg1体外调控细胞衰老的生物学作用。3.D-半乳糖（D-gal,120 mg/kg·d）连续皮下注射诱导小鼠衰老,建立小鼠Sca-1+HSC/HPCs的体内衰老模型,实验分为四组:对照组;D-gal衰老模型组;D-gal+Rg1组;D-gal+Vit E组。研究Rg1体内调控细胞衰老的生物学作用。4.衰老相关指标检测:衰老相关β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal）、造血祖细胞混合集落培养（CFU-Mix）、细胞周期分析。观察体内、外模型中Sca-1+HSC/HPCs的衰老生物学特征;研究Rg1延缓Sca-1+HSC/HPCs衰老的作用。5.氧化应激相关指标检测:ROS水平,经免疫荧光和流式细胞术检测;T-AOC、SOD、GSH-Px及MDA含量检测;Western blot检测4-HNE水平;ELISA法检测8-OHd G和AGEs含量。观察体内、外模型中Sca-1+HSC/HPCs的氧化应激反应情况;探讨Rg1延缓Sca-1+HSC/HPCs衰老与调控氧化应激的关系。6.经典Wnt信号通路相关蛋白基因检测:Western blot分别检测胞质β-catenin、胞核β-catenin、TCF-4、GSK-3β、Phospho-GSK-3β蛋白表达;免疫荧光检测β-catenin、Phospho-GSK-3β蛋白在细胞中的定位表达;实时荧光定量PCR检测β-catenin、c-myc m RNA表达。观察体内、外模型中Sca-1+HSC/HPCs衰老时Wnt/β-catenin信号通路情况;探讨Rg1延缓Sca-1+HSC/HPCs衰老与Wnt/β-catenin信号通路的关系。NAC和Vit E的采用旨在研究Wnt/β-catenin信号通路与氧化应激之间的关系。7.衰老相关途径蛋白基因检测:Western blot分别检测p53、p21Cip1/Waf1、p16Ink4a、Rb和r-H2A.X蛋白表达;实时荧光定量PCR检测p21Cip1/Waf1、p16Ink4a表达。观察体内、外模型中Sca-1+HSC/HPCs衰老时DNA损伤反应、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路情况;探讨Rg1延缓Sca-1+HSC/HPCs衰老与DNA损伤反应、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路之间的关系。DKK1的采用旨在研究Wnt/β-catenin信号通路与DNA损伤反应、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路之间的关系。结果1.采用MACS法分离纯化后Sca-1+HSC/HPCs的纯度达到90.08±2.7%。其比例明显高于分选前MNCs中Sca-1+HSC/HPCs细胞百分比（7.57±1.38%）。并且经台盼蓝染色法检测Sca-1+HSC/HPCs存活率为95%98%。提示运用MACS法分离纯化Sca-1+HSC/HPCs可保持其较高的纯度与活性。2.ox-LDL作用Sca-1+HSC/HPCs后,细胞表现出衰老生物学特征,SA-β-Gal染色阳性细胞百分比明显增高,细胞处于G0/G1期增多、S期比例减少,CFU-Mix集落形成数量明显减少。细胞ROS水平明显增高,细胞培养上清液中SOD、GSH-Px活性明显降低,MDA含量增加。无论是在Sca-1+HSC/HPCs的胞质还是胞核中β-catenin表达均显著上调,且胞核内的增多更为明显;β-catenin、c-myc m RNA表达水平也增高;GSK-3β磷酸化水平明显上升;TCF-4、4-HNE、p53、p21Cip1/Waf1、p16Ink4a、Rb蛋白和p21Cip1/Waf1、p16Ink4a m RNA表达均明显上调;细胞r-H2A.X蛋白表达和培养上清中8-OHd G含量也明显增加。3.人参皂苷Rg1体外作用于ox-LDL处理的Sca-1+HSC/HPCs后,使其SA-β-Gal染色阳性细胞百分比明显降低,G1期比例降低、S期比例有所升高,CFU-Mix数量增多。细胞ROS水平有所降低,细胞培养上清液中SOD、GSH-Px活性增加,MDA含量下降。无论是在Sca-1+HSC/HPCs的胞质还是胞核中β-catenin表达均有所下降,β-catenin、c-myc m RNA表达水平也降低;GSK-3β磷酸化水平有所下降;TCF-4、4-HNE、p53、p21Cip1/Waf1、p16Ink4a、Rb蛋白和p21Cip1/Waf1、p16Ink4a m RNA表达均下调;细胞r-H2A.X蛋白表达和培养上清中8-OHd G含量也有所减少。DKK1或NAC加入处理也能不同程度拮抗ox-LDL诱导的细胞中多个信号通路分子的变化。4.D-半乳糖（D-gal,120 mg/kg·d）连续皮下注射诱导小鼠衰老模型,小鼠Sca-1+HSC/HPCs表现衰老生物学特点。SA-β-Gal染色阳性率明显上升而CFU-Mix集落形成数量明显下降。细胞ROS水平明显增高而T-AOC水平降低,小鼠血清中MDA含量显著升高而SOD、GSH-Px活性明显下降。Sca-1+HSC/HPCs的细胞质和细胞核内的β-catenin表达明显增强,β-catenin、c-myc m RNA水平明显上调;p GSK-3β水平明显增高且细胞质中表达增强;r-H2A.X蛋白表达和血清中8-OHd G、AGEs含量明显增多;小鼠的Sca-1+HSC/HPCs中p16Ink4a、Rb、p53、p21Cip1/Waf1、TCF-4、4-HNE蛋白及p21Cip1/Waf1、p16Ink4a m RNA表达也明显上调。5.人参皂苷Rg1体内作用于D-gal处理的小鼠Sca-1+HSC/HPCs后,使其SA-β-Gal染色阳性率降低而CFU-Mix集落形成数量有所上升。细胞ROS水平下降而T-AOC水平回升,小鼠血清中MDA含量降低而SOD、GSH-Px活性增高。Sca-1+HSC/HPCs的胞质和胞核内的β-catenin表达有所下降,β-catenin、c-myc m RNA水平下调;p GSK-3β水平降低且细胞质中表达减弱;r-H2A.X蛋白表达和血清中8-OHd G、AGEs含量有所减少;p16Ink4a、Rb、p53、p21Cip1/Waf1、TCF-4、4-HNE蛋白及p21Cip1/Waf1、p16Ink4a m RNA表达也有所降低。Vit E加入处理也能一定程度拮抗D-gal体内诱导的细胞中多个信号通路分子的变化,但其作用效果弱于Rg1。结论1.ox-LDL可用于建立Sca-1+HSC/HPCs体外衰老的细胞模型。其作用机制与ox-LDL诱导氧化应激和调控Wnt/β-catenin信号通路有关。2.D-gal的连续皮下注射可以诱导模型小鼠Sca-1+HSC/HPCs衰老发生,可作为Sca-1+HSC/HPCs衰老研究的体内模型。其作用机制与D-gal诱导氧化应激和调控Wnt/β-catenin信号通路有关。3.DNA损伤反应、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路是氧化应激或Wnt/β-catenin信号通路介导细胞衰老的途径。4.人参皂苷Rg1体外作用可通过调控ROS介导的Wnt/β-catenin信号通路,进一步下调DNA损伤反应、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路,从而拮抗ox-LDL诱导的Sca-1+HSC/HPCs衰老。5.人参皂苷Rg1体内作用可调控Wnt/β-catenin信号通路,并且阻遏氧化应激介导的DNA损伤反应、p16Ink4a-Rb和p53-p21Cip1/Waf1通路活化,从而延缓D-gal导致模型小鼠Sca-1+HSC/HPCs的衰老。