真菌毒素玉米赤霉烯酮生物降解关键酶的研究

真菌毒素是一类引起全球食品安全问题的主要生物毒素。玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)是具有雌激素毒性的非类固醇毒素，它在全世界谷物中分布的广泛性和性质的稳定性，使其成为污染饲料和谷物深加工食品的主要真菌毒素。人和动物长期摄入ZEA污染的食物可引发雌激素过多综合症，导致生殖器官的形态发生病变和功能障碍。因此，解决ZEA污染问题已经成为全世界的当务之急。目前，针对ZEA脱毒方面已有相关报道，如吸附、挤压蒸煮和化学降解。然而，这些方法具有破坏营养成分、污染自然环境等缺点，商业用途受到限制。生物降解方法可将ZEA转化成无毒物质，具有广阔的市场前景，日益成为ZEA研究的热点。本研究小组已经从土壤中分离出一株不动杆菌Acinetobacter sp. SM04，它能够将ZEA降解成极低雌激素毒性的产物。并且已从Acinetobacter sp. SM04培养上清液中分离出一种ZEA降解酶-过氧化物酶Prx。本实验在此基础上，主要致力于Acinetobacter sp. SM04培养上清液中具有ZEA降解活性的关键酶的研究，主要包括ZEA降解组分的分离纯化、降解组分的进一步纯化、所得关键酶的基因序列与氨基酸序列的鉴定及在大肠杆菌中的重组表达等。 本实验对不动杆菌Acinetobacter sp. SM04的培养上清液进行分离纯化，得到Peak2组分，该组分可在不添加双氧水的反应体系中有效地降解ZEA，降解率可达70%。而且本实验研究发现，Peak2组分具有强耐碱性，在pH高达10～12的强碱性条件下仍能保持约50%的ZEA降解能力。同时它也具备较好的耐高温性，在60℃时Peak2组分的降解活性达到最大值。 Peak2组分经SDS-PAGE电泳分析，得到四条蛋白条带，分别为Lane1（42KDa），Lane2（30KDa），Lane3（20KDa）和Lane4（16KDa），再经MALDI-TOF/TOF/MS测定，Lane1和Lane2分别被鉴定为outer membrane protein HMP和putative outermembrane protein，与NCBInr Acinetobacter genus数据库有较高的匹配率。NCBInr数据库未确切鉴定出Peak2组分中这两条蛋白的生物功能信息，表明这两条蛋白的具体功能未知。 本实验进一步以Lane2蛋白条带（命名为A4-Oxa）鉴定出的肽序列为基础，设计简并引物进行PCR扩增，再经High-efficiency Tail-PCR扩增法，将两段扩增序列经拼接后，得到编码A4-Oxa蛋白的DNA序列及其理论氨基酸序列。 本论文在所得到编码A4-Oxa蛋白DNA序列的基础上，成功构建了重组表达载体pET32a(+)-A4-Oxa，并将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中，构建了重组大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/pET32a(+)-A4-Oxa。通过IPTG诱导，该重组菌成功表达得到重组目的蛋白A4-Oxa，表达量约为94.75mg/L。高效液相色谱HPLC测试结果表明，重组蛋白A4-Oxa具有ZEA降解活性，对ZEA的降解率达32%。通过研究不同浓度的IPTG与诱导表达时间对重组大肠杆菌表达的影响发现，当IPTG终浓度为2.0mmol/L时，目的蛋白含量最高，IPTG终浓度进一步增加，可降低重组蛋白的表达量。当诱导时间为6h或者8h时，对重组工程菌的表达最有利，此时目的蛋白含量达到最大值。 综上所述，本文成功从不动杆菌Acinetobacter sp. SM04培养上清液中分离纯化得到具有ZEA降解能力的Peak2组分及组分中的A4-Oxa蛋白，并将A4-Oxa在大肠杆菌表达系统中成功获得活性表达，得到的重组A4-Oxa蛋白对ZEA的降解率可达32%，证明A4-Oxa可能参与了不动杆菌Acinetobacter sp. SM04脱毒ZEA的反应途径。本研究结果极大地推动了不动杆菌Acinetobacter sp. SM04降解ZEA机理的研究和ZEA生物降解研究的进展，为研究与开发控制ZEA污染的高效降解方法奠定了基础。