大鼠急性脑缺血再灌注模型的制备和Hephastin表达变化的研究

脑血管疾病是目前人类的三大死亡原因之一，尤其是急性缺血性脑血管疾病发病率高、致残率高，对患者的生活和工作带来严重的影响，早期诊断和治疗是治愈该疾病的关键。为此对急性脑梗塞后的病理生理变化作系统的研究显得尤为重要，而在临床上往往难于做到，就有赖于能模拟临床实际情况的动物模型。大脑中动脉梗塞是急性脑缺血最常见的类型，在实验中应用最多的是大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion MCAO)模型，该模型于1975年开始使用，早期的方法是开颅后烧灼、机械夹闭和光化学方法阻塞MCA，这种方法带有创伤性并且无法实现再灌注，这与临床脑梗塞病人，尤其是脑栓塞病人常常有再灌注的实际情况有符。Koizumi等于1986年报道了新的相对无创伤的方法，通过线栓入MCA制作MCAO模型，拔线后可以实现再灌注。随后Zea Longa等对这种方法作了改进，能比较可靠的制成脑梗塞动物模型。但是这种方法制作的动物模型，在梗塞灶大小和分布上存在较大的变异。这种动物间梗塞灶的变异导致在实验中为了达到统计意义而需要的动物数量大大增加。我们在实验中使用多聚-L-赖氨酸包被的尼龙线制作MCAO模型，多聚-L-赖氨酸是在免疫组化中常用的化学物质，用于包被玻璃片、增加对细胞的粘附力，希望通过增加线端对血管内皮的粘附力，提高模型制作的成功率；同时通过神经功能和病理学评估，来评价该改良线栓法制作MCAO模型的优越性。 目前，制作大鼠脑梗塞模型的方法很多，评价梗塞后神经功能缺损的方法也很多，但是对梗塞体积与神经功能缺损之间关系研究的相关报道较少。本研究的目的是评价本实验所采用的运动功能缺损评分方法能否有效的反映脑组织的损伤程度。 一、大鼠大脑中动脉阻塞模型的实验研究 1、目的：通过大鼠短暂性大脑中动脉阻塞后梗塞体积的测量和神经功能评分，评价改良大鼠大脑中动脉阻塞模型的优越性。 2、方法：分别使用包被有多聚-L-赖氨酸(0.1％)和普通尼龙线，线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型，缺血60分钟和2小时后再灌注，分别在再灌注后3小时、24小时、48小时和72小时联合应用八分法和姿势反射评价运动神经功能， 大鼠急性脑缺血再灌注模型的制备和HePhastin表达变化的研究中文摘要 3天后处死大鼠，测定梗塞体积并进行比较。 3、结果:运动神经功能评分结果与梗死体积成线性关系，多聚一L一赖氨酸包 被线组制作模型的成功率高于普通线组，梗死体积比普通线组大，梗死体积大小 的稳定性好。 4、结论:联合应用八分法和姿势反射评价神经功能缺损能很好的反映脑梗塞 的严重程度;采用多聚一L一赖氨酸包被的尼龙线能使大鼠大脑中动脉阻塞模型更可 靠，成功率高，梗塞体积和部位变异性小。 关键词:动物模型，大脑中动脉阻塞，大鼠，多聚一L一赖氨酸 二、大鼠急性脑缺血后HePhaestin表达变化的研究 铁广泛存在于脑的各个部位，但分布是不均匀的。铁存在于神经系统的许多 细胞中，如神经元、小胶质细胞、少突触胶质细胞和一部分星形胶质细胞，而以 少突触神经细胞中的铁含量最多。脑内铁起着重要生理作用，它是电子传递者， 是线粒体氧化反应和氧运输的重要物质，并参与DNA、RNA、蛋白质合成和髓磷 脂的合成，以及神经髓鞘的发生与发展，同时在多巴胺等神经递质的合成中发挥 必不可少的功能。 一般认为，铁在脑组织中的吸收是通过经典的铁蛋白(transfe币n，Tf)和转 铁蛋白受体(transferrin recePtor，T仪)途径。但近年的研究显示脑细胞的摄铁 机制要比外周复杂的多，脑内铁的平衡机制要比脑外组织复杂的多，除了以转铁 蛋白受体介导的细胞转铁蛋白一fe(Tf-fe)为主要途径外，新发现的其铁代谢蛋白如 二价金属转运体(DMTI)等参与脑的铁代谢。Hephaestin(Hp)是1 999年在肠 中新发现的铁转运蛋白，具有将二价铁转化成三价铁的功能，具有铁氧化酶活性， 同时参与肠上皮细胞铁释放到血液循环中的作用。香港理工大学铁代谢实验室最 近的研究发现，在脑组织中Hp也广泛存在。大鼠大脑中动脉阻塞60分钟后， Northem blot分析发现缺血皮层区L一铁蛋白和H一铁蛋白mRNA出现迟发的长时 间的合成，在再灌注后12小时出现明显升高，并且持续升高到336小时，高峰期 定量分析H一铁蛋白和L一铁蛋白分别升高2.5倍和6倍。L一铁蛋白和H一铁蛋白等表 达变化与脑缺血和铁代谢的变化有关。到目前为止，脑缺血后Hephaestin表达的 变化还未见有研究报道。本研究的目的是观察HePhaestin在大鼠急性脑缺血再灌 1夕 大鼠急性脑缺血再灌注模型的制备和HePhastin表达变化的研究中文摘要 注后的变化规律，以探讨其在急性脑缺血缺氧组织中的作用。 1、目的:研究大鼠急性局灶性脑缺血再灌注后皮层和纹状H即haestin表达的 变化。 2、方法:线栓法制备大鼠急性大脑中动脉阻塞(MCAo)再灌注模型，在再 灌注后的不同时间点应用免疫组化、图像分析和SDS一PAGE westem blot检测皮 层和纹状体Hephaestin表达的变化。 3、结果:HePhaestin在正常大鼠的皮层、纹状体有表达，在急性脑缺血再 灌注后12小时缺血侧皮层、纹状体表达明显增加并持续到再灌注