血必净对严重脓毒症血流动力学影响及内皮功能相关性研究

目的 严重脓毒症是威胁人类健康的重大疾病,尽管给予最佳的治疗,严重脓毒症或脓毒症休克死亡率仍接近40%,而在最严重的患者更超过50%。严重脓毒症患者大多数存在血流动力学障碍,是决定预后的重要因素,心脏功能及血管内皮功能是血流动力学的重要因素。脓毒症心功能障碍是脓毒症最严重的并发症之一,直接导致死亡率升高,目前缺乏有效的治疗手段。寻找临床有效改善脓毒症心功能障碍的药物并探讨其作用机制具有重大意义,中医药在此显出优势。本研究主要集中在两个方面：1、使用中药注射液血必净治疗严重脓毒症患者,以血流动力学指标、心功能指标、内皮功能及APACHE II评分评价效果,统计病死率,探讨血必净治疗严重脓毒症的临床效果。2、动物实验对脓毒症大鼠使用血必净进行干预,观察中药注射液对脓毒症时血清ET-1、 vWF、 eNOS等内皮功能指标；心率、射血分数、心肌活动度等心功能指标；血清及心肌NF-κB表达；心肌病理等指标的影响,并寻找相关性,尝试阐明血必净防治脓毒症心功能障碍的机制。 方法 一、通过临床病例观察血必净对严重脓毒症的治疗作用,重点观察血流动力学、心功能、内皮功能等指标,以2013年2月至2014年2月广东省中医院重症医学科(ICU)符合入选标准的66例患者为研究对象,随机分为对照组和治疗组,对照组按SSC2012年严重脓毒症与脓毒性休克治疗国际指南给予治疗,治疗组在此基础上给予血必净注射液治疗。在治疗前、治疗后24小时及96小时三个时点用心率(HR)、平均动脉压(MAP)、中心静脉压(CVP)、血管活性药用量等评价血流动力学,血乳酸(Lac)、中心静脉血氧饱和度(ScvO2)、动静脉二氧化碳分压差(Pv-aCO2)评估微循环灌注；心脏彩超(左心室射血分数LVEF、心输出量CO、左室舒张末直径LVEDD、快速充盈期与心房收缩期二尖瓣口血液比E/A)及心肌标志物(cTnI、 BNP)评价心功能；VEGF、sFLT-1评价内皮功能,部分患者监测PiCCO指标(胸腔内血管容积指数ITBVI、全心舒张末容积指数GEDVI.血管外肺水指数ELVWI、外周血管阻力指数SVRI、每搏输出量变异度SVV,评价分析两组患者上述指标前后变化是否存在差异,并作相关性分析,寻找心功能、血流动力学与内皮功能的关系。对可能影响预后的指标采用多元Logistic回归分析,得出其中的预后危险因素。 二、通过盲肠结扎穿孔(CLP)法制作脓毒症大鼠模型观察,把大鼠分为三组,分别是假手术组(Sham)、模型组(CLP)以及CLP+血必净组(XBJ),应用物理、生化、免疫组化及病理学等方法观血必净对脓毒症大鼠模型的行为、体温、呼吸、心率、心功能(LVEF、 LVISD、 LVIDD、室间隔活动度)、内皮功能(ET-、 vWF、 eNOS)以及外周血、心脏的NF-κB等指标变化和组织病理上的影响。 三、统计学处理：采用SPSS18.0统计软件,进行数据管理和统计分析。计量资料以x±S表示,非正态分布的数据用非参数检验进行处理,组问比较采用t检验或方差分析；分类变量以率表示,采用x2检验进行比较；单因素相关采用Pearson分析；对预后危险因素预测采用多元Logistic回归分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。 成果 一、临床病例分析 (一)两组患者组内与治疗前比较治疗后APACHE II评分都有所下降,其中对照组无统计学差异,治疗组下降有统计学差异。两组间比较,治疗前APACHE II评分无统计学差异,治疗后治疗组呈现出低于对照组的趋势,但未有统计学差异。同样,ICU住院天数及28天死亡率比较,治疗组有优于对照组的趋势,但未有统计学意义。 (二)两组治疗前HR、 MAP、CVP、血管活性药用量比较无统计学差异,两组按指南复苏后,HR、MAP、 CVP皆比治疗前好转；而治疗组升压药物用量减少,且在治疗后96小时MAP高于对照组,其余指标与对照组同时点比较有好转趋势,但无统计学差异。两组治疗前LAC、ScvO2、Pv-aCO2比较无统计学差异,两组按指南标准复苏后,LAC、ScvO2、 Pv-aCO2皆比治疗前好转,而治疗组在24h呈现出优于对照组趋势,但两者比较无统计学差异。 (三)两组治疗前cTnI及BNP比较无差异,治疗后对照组心肌标志物有所上升,但无统计学差异,治疗组心肌标志物下降,其中cTnI呈下降趋势,而BNP明显下降,与对照组及本组治疗前比较皆有统计学差异。 (四)对照组治疗后LVEF有所下降,CO及SV有增加趋势,LVEDD增加,E/A<1的情况无明显改变；治疗组治疗后LVEF有上升,且高于对照组,两组比较有统计学差异；CO及SV有升高趋势,LVEDD变化不明显,皆无统计学意义,E/A<1的情况有改善。而按脓毒症心功能障碍相关诊断标准,66名患者中存在脓毒症相关心功能障碍的患者有49名,发生率为74.2%,其中收缩功能障碍26名,发生率为39.4%；舒张功能障碍45名,发生率为68.1%。 (五)根据双变量相关分析Pearean系数进行分析提示：CO与P,-aC02呈负相关(入组时r=-0.344,P=0.007<0.01；治疗后96h时r=-0.379,P=0.003<0.01)。CO与CVP呈正相关(入组时r=0.321,P=0.009<0.01；治疗后96h时r=0.471, P=0.000<0.01)。CVP与Pv-aC02呈负相关(入组时r=-0.603,P=-0.00<0.01；治疗后24h时r=-0.764,P=0.00<0.01；治疗后96h时r=-0.784,P=0.00<0.01)。 (六)对照组患者治疗后GEDVI、 ITBVI呈上升趋势,ELVWI下降趋势,但无统计学差异,可能与病例数不足有关,而SVV明显下降,提示经复苏治疗后,患者前负荷好转,血管外肺水降低,而SVRT有所波动；治疗组GEDVI、ITBVI变化不明显,考虑与病例数较少,部分患者容量状态已较稳定有关,而ELVWI下降,提示肺循环渗出减少,SVV明显下降,提示前负荷状态得到改善,患者的容量反应性下降。 (七)对照组患者治疗后血浆VEGF水平变化不明显,sFLT-1有下降趋势,但无统计学差异；治疗组治疗后VEGF水平变化不明显,sFLT-1明显下降,与治疗前及对照组相比有统计学差异,提示能有效降低sFLT-1水平。 (八)据双变量相关分析Pearean系数进行分析提示：sFLT-1与MAP呈负相关(入组时r=-0.557,P=0.000<0.01；治疗后96h时r=-0.569, P=0.000<0.01); sFLT-1与Scv02呈负相关(入组时r=-0.502,P=0.000<0.01；治疗后96h时r=-0.341,P=0.008<0.01)。sFLT-1与血乳酸(Lac)呈正相关(入组时r=0.694,P=0.000<0.01；治疗后96h时r=0.749, P=0.000<0.01); sFLT-1与APACHE Ⅱ评分呈正相关(入组时r=0.258,P=0.036<0.05；治疗后96h时r=0.645,P=0.000<0.01)。VEGF与Lac呈负相关(入组时r=-0.462,P=0.000<0.01；治疗后96h时r=-0.44,P=0.000<0.01),与ScvO2及APACHE Ⅱ评分无明显相关性。 (九)66名严重脓毒症患者,其中15名在28天内死亡,51名存活,28天死亡率为22.7%,死亡组与存活组两组比较在年龄、APACHE Ⅱ评分、心率、sFLT-1、是否使用血管活性药及是否合并脓毒症心功能障碍方面有统计学差异,提示入组时死亡组患者年龄较大,APACHE Ⅱ评分高,心率增快、内皮功能标志物升高,需更多的使用血管活性药及合并脓毒症心功能障碍会导致血流动力学更不稳定。 (十)多元Logistic回归分析严重脓毒症患者死亡风险,结果显示APACHE Ⅱ评分、年龄、sFLT-1可在一定程度上预测严重脓毒症患者的预后。 二、动物实验研究 (一)按照CLP大鼠模型的诊断标准,在造模后12-24小时之间,选择脏器功能较差的数据作为评定。结果显示,造模后12小时大鼠的体温下降,呼吸、心率升高,与Sham组比较均有显著性差异(P<0.05),提示CLP大鼠出现炎症表现,符合脓毒症动物模型。CLP大鼠心脏及肺组织出现病理改变,CLP组与XBJ组死亡率无统计学差异。 (二)造模24小时后CLP及XBJ大鼠较Sham心率明显上升LVEF及IVS活动度下降,LVISD及LVIDD上升,两者比较有统计学差异。而在CLP组给予生理盐水腹腔注射,到48小时后HR较24小时下降,两者比较有统计学差异,提示炎症反应减轻及液体复苏有效降低心率。在XBJ组,腹腔注射XBJ后,24小时及48小时与CLP同时点比较皆表现出心率下降、LVIDD减少、LVEF及IVS活动度升高,两者比较有统计学意义。 (三)造模后24小时,CLP组及XBJ组ET-1及vWF较Sham组升高,eNOS降低,具有统计学意义,提示CLP大鼠存在内皮功能损伤；而在48小时同组比较ET-1、 vWF已有较明显的降低趋势,eNOS有升高趋势(未有统计学差异),提示内皮功能改变发生在脓毒症早期,到中后期有一逐步抑制的过程。XBJ24小时ET-1、vWF水平低于CLP组,eNOS高于CLP组,到48小时这种差异减少,仅在ET-1存在统计学差异。 (四)根据双变量相关分析Pearean系数进行分析提示：大鼠LVEF与ET-1有一定负相关,r=-0.806, P=0.000<0.01, LVEF与eNOS有一定正相关,r=0.835,P=0.00<0.01。 (五)造模后24小时,CLP组及XBJ组大鼠血清NF-K B水平较Sham组明显升高,具有统计学差异,提示CLP大鼠循环中NF-κ B被激活,表达升高,而在48小时出现下降,提示其激活多在脓毒症早期出现,中晚期水平会有下降趋势；而在XBJ组24小时血清NF-κB水平低于CLP组,两者比较有统计学意义。 (六)根据双变量相关分析Pearean系数进行分析提示：大鼠血清NF-κB与ET-1及vWF有一定正相关,其相关系数分别为r=0.749,P=0.000<0.01,r=0.666, P=0.00<0.01。NF-κ B与eNOS有一定负相关,r=-0.67,P=0.000<0.01。 (七)Sham组偶见NF-κB表达阳性细胞,细胞质浅黄色且阳性率较低,显著低于CLP组。CLP组可见大量阳性细胞,多数为棕黄色,阳性率高。XBJ组阳性细胞减少,多数为浅黄色或黄色,且阳性率较模型组明显降低。K-W秩和检验中两两比较方法检验,CLP组与Sham组比较P<0.05,有统计学差异,CLP组与XBJ组比较P<0.05,有统计学差异。 结论 一、严重脓毒症患者存在血流动力学障碍,微循环灌注不足,血流动力学参数与微循环灌注指标有较好的相关性,血流动力学是否稳定与心功能及内皮功能相关。 二、脓毒症心功能障碍的心脏彩超主要表现为：大部分出现心室扩张,可分别或合并存在收缩功能障碍(主要表现为LVEF下降)及舒张功能障碍(主要表现为(E/A<1),并且会出现心肌标志物(cTnI、 BNP)升高。 三、严重脓毒症患者存在明确的内皮功能损伤,其中sFLT-1可反映预后,可作为较为理想的内皮损伤指标。 四、血必净可有效降低APACHE II评分,部分改善严重脓毒症患者血流动力学指标,改善心功能,其机制可能与其改善内皮功能相关。 五、血必净可改善CLP大鼠心功能,心功能与内皮功能有一定相关性,内皮功能障碍可能是脓毒症心功能障碍的其中一个重要机制。 六、血必净可改善内皮功能,降低内皮细胞标志物浓度,其机制可能与其干预NF-κB信号通路,降低NF-κ B的表达,从而增加eNOS表达,减少内皮损伤。