固定化金属亲和载体的制备及应用

12 种琼脂粉分别经pH4.0, 0.04mol/L 醋酸钠缓冲液和pH 9.0, 0.05mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液抽提,环氧氯丙烷活化,交联上螯合剂亚氨基二乙酸,制备得到固定化金属亲和载体,以带六组氨酸标签的重组戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶吸附量为指标进行筛选。以所获最优的载体进一步优化重组戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶的吸附条件,发现15℃、磷酸钠缓冲液浓度100 mM、pH 8.0、钴离子浓度21 umol/ml 为最佳。 在上述条件下一步亲和纯化固定化重组戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶和重组青霉素G 酰化酶,获得的固定化酶活力分别为100U/g 和557.57U/g。其中,固定化戊二酰-7-氨基烷酸酰化酶酶活和固定化在TALON 金属树脂、Sepabeads FP-IDA 的相当,是Sepabeads EC-IDA 的1.5 倍。固定化青霉素G 酰化酶固定化酶活是Eupergit C 的1.47 倍,是Sepabeads Ec-Ep 和Amberzyme 环氧树脂的2.2 倍。 使用Sepabeads FP-IDA 作为纯化用固定化金属亲和载体,测得D-氨基酸氧化酶酶活力为400 U/ml 的粗抽提液的穿透体积为1 倍柱床体积。以含50 mM 咪唑的缓冲液可以将过氧化氢酶彻底去除,以含500 mM 咪唑的缓冲液可完全洗脱D-氨基酸氧化酶,纯化收率为20%,纯化倍数为3.2 倍。