鹿源性大肠杆菌对β-内酰胺类药物耐药相关机制的研究

大肠杆菌是人医和兽医临床感染中最常见的病原菌之一。其血清型复杂，无理想的疫苗来预防，多采用有效的抗生素进行治疗。由于抗生素的广泛、持续和不当使用，导致大肠杆菌耐药株不断增多，耐药机制不断变迁，有时甚至找不到可治之药。近年来，鹿大肠杆菌病的发生呈现上升趋势，给养鹿业造成了巨大的经济损失。因此，开展鹿源致病性大肠杆菌耐药性研究，具有重要的理论和实际意义。 本研究通过药敏性实验对从吉林、河南及其它一些省市地区临床分离的鹿源致病性大肠杆菌进行了耐药性初步调查，选取了10株对β-内酰胺类抗生素具有不同耐药强度的菌株，进行了6种β-内酰胺类抗生素最小抑菌浓度(MIC)的测定，确定致病菌的耐药谱；对β-内酰胺类抗生素耐药相关基因blaAmpC、pbpA、ompFA、ompCA进行了PCR检测、克隆与测序，分析它们与耐药强度的相关性；同时应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)与Western-blot方法对超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)编码基因—blaAmpC的mRNA转录水平及蛋白表达水平进行了定量测定。 结果显示，10株菌的MIC在2～256μg／mL之间，它们对临床应用较多的氨苄西林、阿莫西林的耐药性很高，除6号、8号株对氨苄西林的MIC分别为16μg／mL、18μg／mL，其它菌株MIC均≥128μg／mL。阳性克隆质粒的测序结果显示，与GeneBank中所参考序列相比：青霉素结合蛋白(PBP)编码基因pbpA有5个碱基发生了突变，1个氨基酸发生了改变；外膜蛋白(OMP)基因ompFA有7个碱基发生了突变，相应7个氨基酸发生了改变；ompCA有11个碱基发生了突变，7个氨基酸发生了改变；blaAmpC基因有2个碱基发生了突变，氨基酸未发生改变。ELISA结果显示成功获得了blaAmpC蛋白抗体且抗体滴度达10，000倍。经real-time PCR及Western-blot检测显示耐药水平高的菌株其mRNA及ESBLs表达水平也高。 结果表明，本实验所分离的鹿源致病性大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药十分严重，因此在治疗前对病原进行耐药性检测十分必要；PBP发生改变及OMP通透性改变常引起低水平耐药，而本实验分离的大肠杆菌耐药水平很高，所以受试大肠杆菌耐药现象可能与PBP2、OmpF和OmpC改变有一定关系，但不是主要因素；受试大肠杆菌blaAmpC基因的mRNA和蛋白表达水平与其耐药水平具有一定的相关性，blaAmpC的mRNA水平与其蛋白表达水平基本一致，因此，blaAmpC基因编码的ESBLs可能是导致本实验所分离大肠杆菌耐药的主要原因。本研究的顺利完成，不仅对鹿大肠杆菌病的临床治疗有一定的指导意义，也为深入研究大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制奠定了基础。