香连丸是由黄连和木香组成的复方制剂,具有清热化湿,行气止痛的功效,主治湿热痢疾、里急后重、腹痛泄泻、菌痢、肠炎。方中黄连占80%，为主药；木香则起重要的辅助作用；吴茱萸制黄连抑制黄连苦寒之性,使其寒而不滞。近年来关于香连丸的质量研究以小檗碱的含量测定为主。随着中药现代化进程的加快,单单以一种活性组分的含量对中药制剂进行质量控制已远远不能满足现代中药发展的需要。为了提升中药复方制剂香连丸的质量控制水平,我们对香连丸中三种生物碱和两种倍半萜内酯类化合物进行了含量测定研究,并建立了香连丸中生物碱类成分的指纹图谱,以期为全面控制香连丸的质量提供方法基础。众所周知,中药之所以具有丰富的活性,依赖于其丰富的活性组成成分,这些活性组分的体内动态变化规律研究可以为其活性作用机理的阐释提供理论基础,为其临床用药提供科学依据；目前尚未见香连丸中活性组分的体内动态变化规律研究的报道。鉴于此,我们对来自于香连丸的两种中药活性倍半萜内酯-木香烃内酯和去氢木香内酯在小鼠体内的药物代谢动力学进行了研究；并详细研究了这两种活性组分在小鼠各组织中的分布。另外,为了给体内过程研究提供物质基础,我们建立了木香中的活性成分木香烃内酯和去氢木香内酯的反相高效液相(RP-HPLC)半制备方法。
主要研究内容包括以下三个方面：
一.香连丸的质量标准研究
1.建立了香连丸中三种季胺型生物碱巴马汀、药根碱和小檗碱含量测定方法。本实验采用高效液相胶束色谱,Kromasil ODS(5μm,4.6 mm X 150 mm)色谱柱,流动相：0.2 mol.L-1NaH2PO4水溶液-7.00 mmol.L-1十二烷基硫酸钠-乙腈(35：35：30,Ⅴ：Ⅴ：Ⅴ),流速1.0 mL.min-1,柱温30℃,检测波长为350 nm。香连丸中小檗碱、药根碱和巴马汀的标准曲线分别为A=3.37×104X-2.65×104(r=0.9999),A=4.58×103X-2.88×103(r=0.9997),A=5.62×103X-9.46×103(r=0.9994)；平均回收率分别为87.67%(RSD=0.17),102.37%(RSD=0.98),96.81%(RSD=3.13)。按照该方法测定了市售及自制香连丸中小檗碱、药根碱和巴马汀的含量,结果显示它们的平均含量分别为45.77 mg.g-1,3.89 mg.g-1,9.88 mg.g-1(佛慈药(?)')；86.53 mg.g-1,16.66 mg.g-1,18.59 mg.g-1(自制香连丸)。
2.建立了香连丸中两种倍半萜内酯-木香烃内酯和去氢木香内酯的含量测定方法。本实验采用反相高效液相色谱,Hypersil ODS(5μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱,流动相：乙腈-水(70：30，Ⅴ：Ⅴ),流速1.0 mL.min-1,柱温30℃,检测波长为210 nm测定木香烃内酯和去氢木香内酯的含量。其标准曲线,相关系数及线性范围分别为A=1.30×105X一3.38×104(r=0.9998),0.0223-0.178 mg.ml-1；A= 1.68×105.X一3.34×104(r=0.9993),0.023-0.182 mg.ml-1；平均回收率为98.50%(RSD=0.53),95.30%(RSD=0.32)。市售香连丸中的平均含量为：1.23mg.g-1,1.17 mg.g-1；自制香连丸中的平均含量为：2.41 mg.g-1,2.13 mg.g-1；实验还对组方药材-木香中的木香烃内酯和去氢木香内酯进行了含量测定,经测得,其平均含量为：14.93 mg.g-1,13.16 mg.g-1(惠仁堂)；15.67 mg.g-1,11.19 mg.g-1(黄河药市)；在实验室所购买的青木香中均未检测到木香烃内酯和去氢木香内酯。
3.建立了香连丸中生物碱类成分的指纹图谱测定方法,色谱条件同季胺型生物碱的含量测定。选用药根碱、巴马汀和小檗碱为参照物,通过对9批自制及6批市售香连丸的指纹图谱的分析,共标定了10个共有峰,建立了香连丸指纹图谱的共有模式。相似度分析表明,在波长350 nm下,15批香连丸的相似度分别为99.80%,99.81%和99.81%(自制),99.80%,99.82%和99.79%(自制),99.76%,99.80%和99.81%(自制),98.15%，98.12%和98.29%(佛慈药厂),98.22%，98.24%和98.27%(湖北某药业公司),平均相似度为99.17%。实验表明,自制与市售香连丸之间,以及自制和市售制剂本身之间具有很好的相关性。在相同的色谱条件下,对黄连药材进行指纹图谱分析,并与香连丸的指纹图谱共有模式进行相似度比较,结果表明,黄连药材与香连丸有10个峰匹配,且10个匹配峰跟香连丸制剂的共有峰的保留时间和紫外吸收几乎完全相同,黄连药材样品与制剂的相似度在99.51%-99.78%之间,其平均相似度为99.59%，RSD为0.076%。表明各个药店购买的黄连药材之间没有大的差别,黄连在炮制前后跟制剂的相似度无明显区别,但炮制的黄连经渗漉后,与制剂的相似度更接近于1,在一定程度上说明制剂所用药材与我们购买到的黄连药材品种、来源、质量及处理工艺相似。
以上结果表明所建立的这5种组分的含量测定方法简便、灵敏、准确,重现性好,不仅可以用于香连丸及制剂药材中这5种组分的含量测定,而且也为含有黄连和木香药材的中药制剂的质量控制提供了方法参考。本实验采用相似度评价结合药材与制剂指纹图谱谱峰匹配及上述的活性组分含量测定等多指标评价的方法,可以用于中药制剂的质量考察,且方法简单,重现性好,具有一定的可操作性。
二.木香醇提物中木香烃内酯和去氢木香内酯的药代动力学及其组织分布研究
1.建立了小鼠血浆中木香烃内酯和去氢木香内酯的HPLC定量分析方法。色谱条件同上述木香烃内酯和去氢木香内酯的含量测定方法,结果表明,两种成分分离度佳,无内源性物质干扰。方法平均回收率在86.5-101.8%之间,日内及日间精密度的RSD均小于5%,最低检测限和最低定量限分别为21.27 ng-mL-1和785 ng·mL-1; 71 ng·mL-1和2.62μg·mL-1并将该法用于小鼠体内木香提取物中木香烃内酯和去氢木香内酯的药代动力学研究——昆明小鼠14组(每组6只,每一取血时间点为1组)单次灌胃给予木香提取物后,于0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0、8.0、12.0、24.0和36.0 h摘眼球取血获取血浆,以乙腈沉淀蛋白,取上清夜挥干,甲醇复溶定容后进样分析。灌胃木香醇提物30 min时,血浆中木香烃内酯和去氢木香内酯的峰浓度分别为0.0133和0.0308 mg·mL-1.用Drug And Statistics of Windows 1.0(DAS 1.0)药代动力学程序进行模拟,结果显示木香烃内酯和去氢木香内酯的血药浓度-时间曲线均符合二室模型,血浆中木香烃内酯和去氢木香内酯的tl/2a和t1/2β分别为0.690和9.908,0.292和11.094 h,相关系数为0.997和0.999,较去氢木香内酯,木香烃内酯吸收较快,而消除较慢。
2.取血后的小鼠颈椎脱臼处死,分离胃、肠、肺、肾、脑、肝和脾等组织(胃及肠用生理盐水将内容物冲洗干净),获取不同时间点的各组织样品,精密称定各脏器组织,加2倍量生理盐水制成匀浆液,再加4倍量的乙腈旋涡5 min,于4000 r.min-1离心10 min,取上清液,50℃下氮气吹干,用500μL甲醇溶解残渣,用0.45 gm微孔滤膜过滤,取上清液20μL。按上述建立的高效液相色谱条件进行测定,木香烃内酯和去氢木香内酯在组织中的最大峰浓度依次为C胃>C肺>C肠>C肾>C脑,分别为0.108和0.159 mg·g-1；0.069和0.078 mmg·g-’；0.010和0.048 mg·g-1；0.0059和0.0069mg·g-1；0.0027和0.0037 mg·g-1,其与血浆峰浓度之比为8.08和5.16；5.17和2.52；0.75和1.56；0.45和0.22；0.20和0.12；在肝脏和脾脏中并未测得上述两种成分,可能原因为：1.木香烃内酯和去氢木香内酯均为小分子脂溶性化合物,其不经过肝脏代谢,而直接经胃粘膜或肠粘膜被吸收；2.肝脏和脾脏对木香烃内酯和去氢木香内酯的摄取率较低；3.由于脾脏的体积小,样品的预处理可能会导致其由于其含量低于检测限而未能检测到。
研究结果表明这两种活性组分能较快的分布于各组织中,且在各组织中的最大浓度次序完全相同,依次是胃,肺,肠,肾,脑。可见两种组分在胃肠中的浓度均较高。这一结论与该药的治疗作用完全吻合。
通过以上研究,为木香烃内酯和去氢木香内酯的作用机理的阐释建立了理论基础,也为其临床应用提供更加科学的依据。
三.木香药材中木香烃内酯和去氢木香内酯的分离制备
利用经典硅胶柱色谱和反相高效液相(RP-HPLC)半制备液相色谱对木香中的活性成分木香烃内酯和去氢木香内酯进行分离制备,经分析HPLC测定纯度,UV、NMR鉴定结构。结果表明,这两种化合物的结构分别为木香烃内酯和去氢木香内酯。该方法制备倍半萜类化合物纯度很高且可靠、简便、快速,可用于食品和中药中倍半萜类化合物的分离制备。
