炎症微环境影响下Wnt信号通路对牙周膜干细胞骨向分化的调控机制研究

目的:干细胞是维持组织器官正常再生能力的重要基础,在组织器官创伤缺损中干细胞通过分化促进其再生修复。前期研究已成功从牙周膜组织中分离培养获得了一种新型的成体干细胞即牙周膜干细胞。牙周膜干细胞具有成体干细胞共有的特性,具有多向分化能力以及干细胞的自我更行能力,它的这些功能使其成为骨再生修复的重要种子细胞。但是,慢性炎症疾病中组织的再生修复能力明显下降,最新研究显示其原因可能是炎症环境下干细胞再生能力受到明显抑制。牙周炎是一种慢性炎症疾病可造成牙周组织中的牙槽骨以及软组织均受损伤。微环境可以影响干细胞的功能,因此我们推测在牙周炎微环境作用下牙周膜干细胞的功能也受到一定的影响,牙周组织结构复杂牙周病为主要的炎性疾病因此牙周膜干细胞可作为研究炎症微环境作用下干细胞功能的理想模型。 炎症通过改变成体干细胞的微环境,产生大量炎症因子来影响内源性干细胞介导的组织再生。炎症因子在骨的损伤及修复过程中发挥重要作用,IL-1β和TNF-α在牙周病的进程中发挥关键作用,这些炎症因子作用于干细胞后可以引起其下游一系列的变化从而可以改变干细胞的功能。炎症因子干扰正常的成体干细胞后可以引起干细胞分化能力的降低已被证实,然而尚无炎症来源干细胞功能的相关报道。因此,本实验将首次研究炎症来源的牙周膜干细胞的生物学行为,明确炎症微环境对牙周膜干细胞骨向分化的影响。 干细胞参与组织再生受多种分子信号通路的调控。牙周炎主要造成牙槽骨的损伤,骨再生成为牙周病治疗的关键,近期的研究结果表明Wnt经典以及非经典信号通路在骨的发育以及再生过程中发挥重要作用。而炎症微环境中干细胞分化过程的分子通路尚未被阐明,极大的阻碍了治疗炎症性疾病新方法和技术的发展。因此拟利用牙周炎来源的牙周膜干细胞作为炎症微环境作用下的细胞模型,结合Wnt信号通路在干细胞骨向分化过程中的作用机制,探讨炎症微环境影响干细胞再生能力的分子机制,并在此基础上进行调控,恢复炎症疾病组织来源的干细胞的组织再生能力,是本课题着重解决的科学问题。 方法: 第一部分:为了获取炎症组织来源的牙周膜干细胞,我们首先在临床上进行样本收集,收集到相应年龄段内正常因正畸治疗需拔除的健康牙齿,炎症来源的则来自于患牙周病且伴牙槽骨吸收因牙周治疗需拔除的患牙。参照正常组织来源牙周膜干细胞(H-PDLSCs)的分离培养方法我们成功获得了炎症组织来源的牙周膜干细胞(P-PDLSCs)。对两种来源的干细胞进行了克隆形成率的检测,采用流式细胞仪技术对获得的细胞进行干细胞表面分子标志物的检测。为了比较正常以及炎症组织来源地牙周膜干细胞的功能我们用MTT法以及流式细胞仪进行细胞活性以及生长周期的检测。干细胞具有多向分化能力,为了进一步比较两种组织来源的干细胞分化能力差异,对两种细胞进行了成脂以及成骨定向诱导分化实验,同时采用实时定量PCR对成骨以及成脂的关键基因RUNX2与PPARγ进行检测。 第二部分:促炎症细胞因子IL-1β和TNF-α是介导牙周膜干细胞炎症反应的重要炎症介质。为了明确我们获得的牙周膜干细胞在经过体外培养后仍然具有炎症特性,我们以IL-1β(5 ng/mL)和TNF-α(10 ng/mL)构建模拟的炎症微环境干扰H-PDLSCs,设PBS对照组,通过Elisa和Real-time RT-PCR方法检测干预后24h随后常规状态培养72h后,H-PDLSCs、P-PDLSCs、H+cytokines三组细胞IL-1β和TNF-α分泌以及mRNA表达情况;按照上述分组Western Blot检测全细胞蛋白β-catenin表达水平。炎症因子可影响细胞的功能因此我们对H-PDLSCs、P-PDLSCs、H+cytokines三组细胞进行成骨能力检测。将细胞成骨诱导7d后采用免疫荧光方法检测成骨的关键蛋白OCN、ALP、BSP的表达情况,同时采用实时定量PCR检测细胞成骨基因RUNX2、OCN、COL-1的表达水平。 第三部分:为了明确炎症微环境作用下Wnt信号通路在PDLSCs成骨分化过程中的作用,我们将H-PDLSCs及P-PDLSCs成骨诱导7d,分离提取胞浆、胞核蛋白或全细胞蛋白。为准确判Wnt/β-catenin信号通路在炎症微环境作用下对干细胞成骨功能的影响,胞浆胞核分离的蛋白进行Western Blot实验检测β-catenin的表达情况。Western Blot检测经典Wnt信号通路重要蛋白GSK3β,非经典信号通路CaMKII与NLK以及成骨的关键蛋白p38MAPK、RUNX2、COL-1的表达水平。 第四部分: Wnt3a可以上调Wnt经典信号通路而DKK-1则为Wnt经典信号通路的阻断剂,此部分实验我们将应用者两种外源性重组蛋白调控Wnt信号通路。采用Western Blot检测加入Wnt3a或DKK-1后Wnt经典以及非经典信号通路关键蛋白β-catenin、CaMKII、NLK。LEF-1的表达情况,同时检测下游Cyclin D1及成骨关键蛋白p38的表达情况。ALP染色观察改变Wnt信号通路活性后干细胞成骨能力的变化,实时定量PCR检测成骨基因RUNX2、OCN、COL-1的变化趋势,流式细胞仪进行细胞周期分析。 结果: 第一部分:正常和炎症组织来源的牙周膜干细胞生物学行为的比较研究 1.与H-PDLSCs细胞相比,P-PDLSCs的细胞形态以及克隆形成率无显著性差异。 2.通过干细胞分子表明标记物检测发现两种细胞表达相似的细胞表型,CD45-但是CD44+、CD90+、CD105+、CD146+、Stro-1+。 3. P-PDLSCs的增殖能力显著高于H-PDLSCs。 4. P-PDLSCs的成脂分化能力与成骨化能力显著低于H-PDLSCs。 第二部分:明确炎症微环境对牙周膜干细胞骨向分化能力的影响 1.炎症微环境作用下牙周膜干细胞IL-1β和TNF-α的分泌合成量及mRNA的表达显著高于对照组。 2.炎症微环境可导致β-catenin表达水平显著升高。 3. P-PDLSCs及模拟炎症微环境作用下的H-PDLSCs细胞中CyclinD1的表的水平显著上升。 4.免疫荧光结果显示在成骨诱导7d后H-PDLSCs、P-PDLSCs、H+cytokines三组细胞均强阳性表达成骨关键蛋白OCN、ALP、BSP。 5.实时定量PCR结果显示,炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨诱导7d后RUNX2、OCN及COL-1的表达水平显著低于H-PDLSCs。第三部分:Wnt经典以及非经典信号通路在炎症微环境影响下牙周膜干细胞骨向分化过程中的作用1. H-PDLSCs与P-PDLSCs成骨诱导7d后胞核内β-catenin表达水平降低而胞浆内则有所升高。同时P-PDLSCs细胞胞浆和胞核β-catenin表达水平高于H-PDLSCs。2. Western Blot结果提示在胞浆内可降解β-catenin的蛋白GSK3β在成骨诱导7d后升高,而P-PDLSCs细胞内的表达量低于H-PDLSCs细胞3.非经典信号通路的关键蛋白CaMKII、NLK在成骨诱导7d后其表达水平升高,但P-PDLSCs低于H-PDLSCs。4. P-PDLSCs与H-PDLSCs p-p38骨诱导7d后其表达水平升高5. Western Blot检测提示成骨诱导7d后P-PDLSCs与H-PDLSCs细胞的RUNX2及COL-1表达量均上升,但P-PDLSCs低于H-PDLSCs。 第四部分:调控Wnt信号通路对炎症微环境影响下牙周膜干细胞骨向分化能力的影响及机制研究 1.上调Wnt信号通路后β-catenin及LEF-1的表达水平升高,Wnt经典信号通路的活性增强,与此同时非经典信号通路则受到抑制。上调Wnt信号通路并成骨诱导之后观察到P-PDLSCs与H-PDLSCs的成骨分化能力显著降低。 2. DKK-1阻断Wnt信号通路之后β-catenin表达水平下降,但是非经典的CaMKII、NLK表达水平上升。DKK-1可显著抑制细胞进入G1期,抑制了细胞的增殖。成骨诱导后可见干细胞的成骨能力增强体现在ALP活性升高成骨基因表达水平显著上升。 结论: 1.本研究成功分离培养获得了炎症组织来源地牙周膜干细胞,通过与正常细胞对比发现炎症影响下牙周膜干细胞的增殖能力增强但分化能力降低。 2.本研究发现了炎症影响下干细胞Wnt经典信号通路被激活,这是导致干细胞骨向分化能力降低的重要原因。 3.Wnt经典与非经典信号通路在干细胞的骨向分化过程中均发挥重要作用。Wnt经典信号通路的增强,非经典信号通路的减弱是P-PDLSCs骨向分化能力降低的重要原因。 4. Wnt经典通路的增强可以抑制干细胞的骨向分化能力,而通过DKK-1抑制Wnt经典信号通路后干细胞的骨向分化能力增强。此外,在炎症微环境作用下干细胞内的Wnt经典与非经典信号通路之间的动态平衡受到破坏,可以通过调控Wnt信号通路以恢复这种平衡关系,增强炎症组织来源干细胞的骨向分化能力。 综上所述,我们的研究结果表明Wnt信号通路在炎症为环境作用下干细胞骨向分化过程中发挥主导作用。本研究不仅加深认识微环境对干细胞的调控作用,而且提示可以通过调控Wnt信号通路改变炎症微环境作用下干细胞的骨向分化能力,为寻求炎症及其相关重大疾病诊治的新策略提供新的理论和实验依据。