三种有机磷农药残留免疫检测方法的建立与应用

本研究以γ-氨基丁酸和农药中间体为原料合成了甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱三种有机磷农药人工半抗原O-甲基-O-（4-硝基苯基）-N-（丁酸）硫代磷酸酯（H1）、O-甲基-O-（3-甲基,4-硝基苯基）-N-（丁酸）硫代磷酸酯（H2）和O-甲基-O-（3,5,6三氯吡啶基）-N-（丁酸）硫代磷酸酯（H3）,利用4-溴代丁酸乙酯和农药中间体为原料合成了另外三种半抗原4-硝基苯基-O-丁酸（H4）,3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸（H5）和3,5,6-三氯吡啶基-O-丁酸（H6）;通过活泼酯法将H1、H2和H3分别交联于牛血清白蛋白（BSA）上制备免疫原,将H1、H2、H3、H4、H5和H6分别交联于卵清蛋白（OVA）上制备包被原。 以等量混合的H1-BSA、H2-BSA和H3-BSA制成的混合免疫原HA-BSA混合免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术,用PEG法将其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化,建立可稳定分泌分别抗甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱的杂交瘤细胞株。结果获得了一株可稳定分泌抗甲基对硫磷的杂交瘤细胞株（3H9/A3）,两株可稳定分泌抗杀螟硫磷的杂交瘤细胞株（3H9/B3、6C8/H6）,一株可稳定分泌抗甲基毒死蜱的杂交瘤细胞株（3G7/F5）,所分泌的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为k链,通过对抗体效价的检测比较,选用3H9/A3、6C8/H6和3G7/F5三株细胞株作进一步研究,三者所分泌的抗体亲和常数分别达1.23×10～8L/mol、2.0×10～7L/mol和3.09×10～8L/mol。细胞株3H9/A3、6C8/H6和3G7/F5所分泌的抗体分别对甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱具有明显的识别作用,为建立三种农药的残留分析奠定了基础。 以杂交瘤细胞株3H9/A3、6C8/H6、3G7/F5分泌的单克隆抗体为基础,通过对检测体系中盐封闭物、离子强度、pH值等影响因子的研究建立了甲基对硫磷、杀螟硫磷以及甲基毒死蜱的ELISA检测体系。以Logit(B/B_o作纵坐标与农药浓度的对数值作横坐标建立标准曲线,甲基对硫磷在0.01μg/ml～10μg/ml范围内呈显著线性关系,检测方程为y=-1.02x-0.9894,相关系数R2达0.9744,IC50为0.107μg/ml,在土壤、自来水以及青菜中的添加回收率分别为84.3%、93.9%、100.5%;杀螟硫磷在0.001ng/ml～100ng/ml范围内呈显著线性关系,检测方程为y=-0.4421x-0.5681,相关系数R2达0.9947,IC50为0.052ng/ml,在土壤、自来水以及青菜中的添加回收率分别为84.5%、99.05%、94.9%;甲基毒死蜱在0.01μg/ml～100μg/ml范围内呈显著线性关系,检测方程为y=-0.9476x-1.0641,相关系数R2达0.9951,IC50为0.075μg/ml在土壤、自来水以及青菜中的添加回收率分别为85.1%、104.8%、90.2%。本研究采用混合免疫方法在一次细胞融合过程中获得了三种单克隆抗体,为能在较短的研制周期内获得多种不同农药的单克隆抗体,提高抗体的产出率提供了理论基础;并用所得抗体分别建立了甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱的三种有机磷农药残留ELISA快速检测法,为农药残留检测试剂盒的开发提供了基础,为环境安全检测提供了重要的工具。