氟西汀改善脑缺血引起的空间学习记忆缺陷及其机制研究

脑卒中(俗称中风)为脑部血管阻塞或破裂引起脑部血流受阻所致病症,是中老年人的常见病、多发病。流行病学调查显示脑卒中存活者中有近30%的患者出现不同形式和程度的认知功能障碍,主要表现为记忆障碍、定向力障碍、空间结构能力障碍、推理思维能力障碍等。其中,记忆障碍者占45.4%。空间学习记忆障碍直接影响脑血管病的康复,已成为脑卒中研究的重点。 近年来,动物实验和临床研究均已经证实成年哺乳动物神经元再生对缺血后脑功能的重建至关重要。空间学习记忆主要依赖于海马,因此海马齿状回(dentate gyrus,DG)的神经元再生对于学习记忆至关重要。大量的文献已经证实局灶性脑缺血能够激发成年哺乳动物侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)以及海马DG区神经元再生,新生神经元能向损伤的脑区迁移而且可以整合到已有的神经回路中形成一定的突触联系,这有利于改善缺血引起的神经功能缺陷及海马依赖性的学习记忆能力。这些研究均提示缺血后空间认知损害可能通过增强海马部位的神经元再生得到改善。 氟西汀被广泛应用于抗抑郁的治疗,其主要作用是抑制中枢神经系统突触间隙的5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再摄取。近年来的研究显示,慢性的氟西汀治疗在生理状态下可以促进哺乳动物海马新生细胞的增殖和存活,然而,在脑缺血后慢性氟西汀治疗能否增强神经元再生从而改善空间学习记忆功能?为了探讨这一问题,我们研究了小鼠局灶性脑缺血后慢性氟西汀治疗对海马DG区神经元再生及空间学习记忆缺陷的影响,为中风后空间认知障碍提供了一个安全有效的治疗方法。本文采用成年小鼠大脑中动脉阻塞(middlecerebral artery occlusion,MCAO)制备局灶性脑缺血再灌注模型,为研究脑缺血后学习记忆障碍提供一种较理想的实验动物模型。 为了研究氟西汀对脑缺血后感觉运动功能及空间学习记忆能力的影响,实验共分为3组:假手术组—给予生理盐水;溶剂对照组—MCAO造模后给予生理盐水;氟西汀组—MCAO造模后给予氟西汀,在MCAO造模后第8天开始给予氟西汀(10 mg/kg,腹腔注射,每日一次),连续给药28天至MCAO造模后第35天结束,同时假手术组及溶剂对照组给予相同体积的生理盐水。 在脑缺血造模后第7,14,21,28,35,42,49及59天分别进行神经损伤严重程度评分(Neurological severity scores,NSS)和足失误测试(foot fault tests,FFT)未评价感觉运动功能。实验结果显示:NSS实验中,各个测量时间点溶剂对照组小鼠神经损伤严重程度评分显著高于假手术组,说明局灶性脑缺血能显著损害小鼠的感觉运动功能;但在氟西汀组和溶剂对照组之间神经损伤严重程度评分没有统计学差异,说明慢性氟西汀治疗对脑缺血后感觉运动功能的恢复没有影响。FFT实验是对小鼠运动中左右两侧前肢放置的协调性进行评估,结果显示各个时间点假手术组小鼠左右两侧前肢的失足率各约50%,氟西汀组及溶剂对照组小鼠缺血对侧前肢失足比例均显著增高,但这两组之间没有显著性差异,这同样说明慢性氟西汀治疗对脑缺血后运动协调功能的恢复没有影响。 在MCAO造模后第22-28天、50-59天即氟西汀治疗两周、四周后分别进行MorriS水迷宫实验(Morris water maze,MWM)检测氟西汀对空间学习记忆能力的影响。 在氟西汀治疗两周时,MWM隐蔽平台试验氟西汀组和溶剂对照组逃避潜伏期及游泳路线的长度均显著长于假手术组;但氟西汀组和溶剂对照组之间没有显著性差异,同样空间探索试验中氟西汀组和溶剂对照组小鼠在原平台象限的停留时间及穿越原平台位置的次数亦均没有统计学差异。说明局灶性脑缺血导致空间学习记忆能力明显受到损害,但氟西汀治疗两周对脑缺血引起的空间学习记忆损害没有改善作用。 氟西汀治疗四周并停药两周后,MWM隐蔽平台试验氟西汀组逃避潜伏期和游泳路线的长度显著短于溶剂对照组,接近假手术组,说明慢性氟西汀治疗能改善脑缺血后的空间学习记忆损害;并且在三组之间游泳速度没有显著差异,排除了动物体力差异对空间学习记忆能力的影响;空间探索试验中氟西汀组在原平台象限的停留时间及穿越原平台位置的次数均显著多于溶剂对照组。为了排除视觉对空间学习记忆的影响进行可视平台试验,结果显示三组的逃避潜伏期没有统计学差异,因此排除了视觉障碍对动物空间学习记忆能力的影响。 行为学实验结束后取小鼠脑组织进行TTC染色显示溶剂对照组与氟西汀组脑组织梗死面积的大小没有显著差异,以上研究结果说明慢性氟西汀治疗对脑缺血后感觉运动功能的恢复没有影响,但能改善脑缺血后的空间学习记忆损害,且不是由于梗死面积的缩小引起的。 为了研究海马神经元再生与氟西汀改善脑缺血后空间学习记忆功能之间的相互关系。 首先,我们观察了氟西汀给药对脑缺血后神经元再生的影响,我们在MCAO造模后19-21天(氟西汀给药后第12-14天)给予5-溴脱氧尿核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU:一种公认的新生细胞标记物)50mg/kg,连续给药6次,给药间隔为12小时,标记新生细胞。最后一次BrdU注射24h和28天后处死动物,观察氟西汀是否调控海马DG区细胞的增殖和存活。BrdU阳性细胞计数结果表明:三组之间缺血侧及对侧新生细胞的数目均没有显著差异,但氟西汀组缺血侧及对侧存活的细胞数与溶剂对照组相比,均显著增多,对照组和假手术组之间存活的细胞数没有差异,说明慢性氟西汀治疗对缺血后海马DG区神经元的增殖没有影响,但能促进新生细胞的存活。 其次,为了进一步探讨氟西汀改善脑缺血后空间学习记忆功能是否依赖于海马神经元再生,我们运用端粒酶抑制剂3-叠氮脱氧胸苷(3'-azido-3'-deoxythymidine,AZT)阻断海马神经元再生。本实验室前期研究表明,在生理状态下,端粒酶抑制剂AZT显著抑制了小鼠海马齿状回神经元的增殖及存活。造模后实验动物共分为三组:溶剂对照组—MCAO造模后给予生理盐水;氟西汀组(FLX组)—MCAO造模后给予氟西汀;FLX+AZT组—MCAO造模后先给予AZT半小时后再给予氟西汀,小鼠氟西汀给药前半小时(MCAO后8-35天)腹腔注射AZT(100mg/kg,给药28次,间隔24小时),第19-21天给予BrdU(50mg/kg,连续给药6次,给药间隔为12小时)标记新生细胞。末次BrdU注射28天后检测海马神经元再生,并进行Morris水迷宫实验。 结果显示:氟西汀治疗前半小时给予AZT,能够削弱氟西汀诱导的缺血后DG区神经元再生的上调,FLX+AZT组缺血侧及对侧Brdu阳性细胞数分别比FLX组减少了46%和37%接近溶剂对照组。且在水迷宫实验中,隐蔽平台试验中与FLX组、溶剂对照组相比,FLX+AZT组逃避潜伏期及游泳路线的长度均显著延长,以上结果说明AZT能够削弱氟西汀诱导的缺血后DG区神经元再生的上调,且此时氟西汀改善缺血后空间记忆损害的效应消失。 结论:慢性氟西汀治疗对脑缺血后感觉运动功能的恢复没有影响;脑缺血后慢性氟西汀治疗不影响海马DG区神经元的增殖,但能够促进新生细胞的存活,并逆转缺血引起的空间学习记忆损害。海马神经元再生的上调是氟西汀改善缺血后空间学习记忆损害所必需的。