8-MOP诱导HepG2细胞凋亡及其机制探讨

肝癌在我国癌症发病率中居第二位，目前对中、晚期及复发性肝癌尚无特效治疗药物。中医药综合治疗因能改善患者临床症状，延长生存期，改善生活质量而倍受关注。呋喃香豆素类天然化合物8-甲氧补骨脂素（8-methoxypsoralen，8-MOP）来源于芸香科植物崖椒(Fagava zanthoxyloides Lam.)果实，芸香(Rutagraveolens L.)全草等，也可以化学合成。现在被广泛运用于心绞痛、白癜风、牛皮廯以及皮肤T淋巴细胞瘤的治疗。目前研究发现8-MOP联合紫外光可参与调节表皮细胞生长和分化。近来有报道称8-MOP同分异构体5-甲氧补骨脂素（5-methoxypsoralen，5-MOP）具有细胞毒作用，不依赖紫外线激活可抑制肝癌细胞株J5细胞殖并诱导其发生凋亡。此外还有报道5-MOP可通过激活p38MAPK信号通路促进p53表达从而诱导人乳腺癌细胞株MCF-7和SKBR-3细胞凋亡。但是还没有关于单独使用8-MOP对肝癌细胞株生长抑制和凋亡诱导的报道。 软骨细胞差异表达蛋白（differentially expressed in chondrocytes，DEC）属于基本螺旋环螺旋结构蛋白（basic helix-loop-helix protein，bHLH），参与了凋亡、细胞增殖、周期节律、恶性肿瘤发展和缺氧反应的调节。研究发现，DEC1在乳腺癌和结肠癌的组织中高表达。分别过表达和敲除DEC1或DEC2可影响Bcl-2、Fas、Bax、c-Myc、survivin、血管内皮生长因子(VEGF)、剪切PARP (polyADP-ribose polymerase)以及胱门蛋白酶（caspases）等凋亡相关因子的表达。然而DEC1在抗肿瘤药物诱导凋亡中的作用至今不明确。 目的：研究单独使用8-MOP对体外HepG2细胞增殖及凋亡的影响，并初步探讨相关机制。 方法： 1.不同浓度的8-MOP(1-64μM)作用于肝癌细胞株HepG212，24，48，72h，用MTT法测定8-MOP对HepG2细胞的生长抑制作用，并拍照观察细胞形态学变化。选用0，3，10和30μM为作用浓度，48h为作用时间进行进一步的研究。 2.不同浓度的8-MOP作用于HepG2细胞48h之后：Hoechst33346染色后荧光显微镜下观察有无细胞凋亡；流式细胞仪法检测凋亡和确定凋亡率；Western Blot法检测p53，caspase-3，caspase-9，caspase-8，Bax，Bcl-2，survivin蛋白表达变化。 3.为了探讨8-MOP的作用机制，用realtimePCR法和Western Blot法检测了核受体DEC1的表达。 4. HepG2细胞中瞬时转染DEC1，8-MOP作用48h后，用Hoechst33346染色后荧光显微镜下观察8-MOP诱导细胞凋亡的作用有无影响，Werstern Blot法检测survivin和caspase-3的表达。 结果： 1.8-MOP对HepG2细胞活力有抑制作用。(1)MTT试验证实8-MOP（1～64μM）对肝癌细胞的增殖抑制效应具有时间，浓度依赖性。(2)不同浓度8-MOP(1～64μM)作用48h，细胞形态学实验结果表明，处理后细胞形态学发生明显变化，如皱缩、聚集等。 2.8-MOP可诱导HepG2细胞凋亡。(1)8-MOP（0，3，10，30μM）作用48h后，HepG2细胞经Hochest33346法染色，在荧光显微镜下可以观察到凋亡现象：细胞体积缩小，染色质浓缩，并见核碎裂。(2)通过流式细胞技术显示，8-MOP（0，3，10，30μM）作用48h后，肝癌细胞HepG2发生了凋亡，凋亡率分别为5.1％，5.4％，9.8％和17％。 3.8-MOP可影响凋亡相关蛋白表达。8-MOP（0，3，10，30μM）作用48h后，Western Blot检测证实，8-MOP能激活caspase-3，caspase-8and caspase-9，上调Bax/Bcl-2的表达比值，其中Bax表达增加，Bcl-2表达下降。此外，8-MOP能p21WAF1/Cip1和Bax调节子p53的表达增加。同时我们还发现8-MOP能使凋亡抑制基因家族中的成员生存素（survivin）表达下降。 4.8-MOP可影响凋亡相关核受体DEC1的表达。不同浓度8-MOP（0，3，10，30μM）作用48h后：（1）Realtime PCR检测证实，8-MOP作用于肝癌细胞后：DEC1mRNA表达受到抑制，且成浓度依赖性。(2)Western Blot检测证实，DEC1表达受到抑制，并且与浓度成依赖关系。 5. DEC1在8-MOP诱导的HepG2细胞凋亡中的作用。瞬时转染DEC1，30μM8-MOP作用48h：（1）经Hochest33346法染色发现，过度表达DEC1可减弱8-MOP诱导细胞凋亡作用；（2）Western Blot检测证实，过表达DEC1可部分拮抗8-MOP诱导的survivin和caspase-3酶原水平降低的程度。 结论： 1.8-MOP对HepG2细胞具有生长抑制和凋亡诱导作用。 2. DEC1表达的抑制是8-MOP诱导HepG2细胞凋亡的作用机制之一，DEC1可能是8-MOP抗肝癌作用的一个重要靶标分子。 3.8-MOP具有治疗肝癌的应用前景。 本文工作的主要创新之处在于：天然化合物8-MOP联合紫外光可参与调节表皮细胞生长和分化。近来有报道称8-MOP同分异构体5-MOP可抑制多种癌细胞株增殖并诱导其发生凋亡。但是还没有关于单独使用8-MOP对肝癌细胞株生长抑制和凋亡诱导的报道。DEC1和DEC2参与了凋亡，细胞增殖，周期节律，恶性肿瘤发展和缺氧反应的调节。研究发现，DEC1在乳腺癌和结肠癌的组织中高表达，然而DEC1在抗肿瘤药物诱导凋亡中的作用至今不明确。因此，本文研究了8-MOP对HepG2细胞的促凋亡作用，并探讨了DEC1在HepG2细胞凋亡中的作用。