皱盖疣柄牛肝菌多糖结构分析及生物活性研究

皱盖疣柄牛肝菌（Leccinum rugosiceps）又名虎皮牛肝菌,隶属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌目（Agaricales）牛肝菌科（Boletaceae）疣柄牛肝菌属（Leccinum）,是一种丛生的药食两用根菌。目前对于皱盖疣柄牛肝菌的研究主要集中在阴离子、金属等成分分析,对于其多糖的研究较少。本课题展开了对皱盖疣柄牛肝菌多糖进行提取、分离纯化、结构鉴定以及生物活性等方面的研究。主要研究结果如下:（1）利用湿法打浆提取皱盖疣柄牛肝菌粗多糖,用单因素实验和响应面分析优化提取工艺,得到最佳提取工艺条件为:料液比1:35,温度80℃,打浆时间7 min,重复3次,得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖的实际得率为4.58%,优于传统热水浸提法提取多糖。（2）皱盖疣柄牛肝菌粗多糖,经脱色、Sevage脱蛋白、浓缩、透析等步骤,得到皱盖疣柄牛肝菌粗多糖（LR）。LR经DEAE-52柱层析得到两种组分相对均一的杂多糖LR-I、LR-III和一种混合多糖LR-II,质量分别占上样量的17.17%、46.40%、19.45%。多糖LR-I、LR-III经凝胶渗透色谱和Sephadex G-100柱层析洗脱分析鉴定其为组分相对均一的纯化多糖,重均分子量Mw分别为1.4×10～4 Da、1.6×10～4 Da。对皱盖疣柄牛肝菌纯化多糖LR-I、LR-II及LR-III进行了理化性质分析,结果表明LR-I为米白色蓬松絮状物质,总糖含量47.71%,蛋白质含量0.03%,糖醛酸含量4.31%;LR-II为米白色蓬松絮状物质,总糖含量86.45%,蛋白质含量0.17%,糖醛酸含量9.50%;LR-III为淡黄色蓬松絮状物质,总糖含量59.90%,蛋白质含量0.49%,糖醛酸含量10.00%,均不含可溶性淀粉和核酸。（3）对LR-I、LR-III进行结构分析,结果表明LR-I主要由葡萄糖醛酸、鼠李糖、岩藻糖,甘露糖,葡萄糖、半乳糖6种单糖组成,单糖的摩尔比是1:2.91:7.34:40.37:57.54:37.90。高碘酸氧化和Smith降解结果表明多糖LR-I含有1,2→（1,4→）、1→（1→6）和1,3→型糖苷键,三者的摩尔比为10.2:2.8:2.4。结合红外光谱、核磁共振和甲基化等方法分析,多糖LR-I同时含有α和β两种构型糖残基,且α-构型含量大于β-构型的。可能是由1,6-D-葡萄糖、1,6-D-甘露糖构成主链,1,6-D-甘露糖、1,6-D-半乳糖和1,4-D-葡萄糖等构成支链;LR-III主要由葡萄糖醛酸、鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6种单糖组成,单糖的摩尔比是:1.46:1:3.41:8.07:56.80:15.71。高碘酸氧化和Smith降解结果表明多糖LR-III含有1,2→（1,4→）、1→（1→6）和1,3→型糖苷键,三者的摩尔比为6.4:1.4:7.6。结合红外光谱、核磁共振和甲基化等方法分析,多糖LR-III同时含有α和β两种构型糖残基,且β-构型含量大于α-构型的。可能是由1,3-D-葡萄糖和1-D-葡萄糖构成主链,1,6-D-半乳糖和1,2-D-甘露糖等构成支链。刚果红和扫描电镜实验表明多糖LR-I和LR-III均存在三螺旋空间构象,多糖LR-I主要呈片状,多糖LR-III主要为条状,结构更复杂。（4）皱盖疣柄牛肝菌多糖生物活性研究表明,皱盖疣柄牛肝菌多糖各组分均有一定的抗氧化活性,包括不同程度的Fe3+还原能力、清除DPPH自由基能力和清除ABTS+自由基能力。且在0.625～10 mg/mL浓度范围内,抗氧化活性与多糖的浓度成正相关。其中粗多糖LR各方面抗氧化活性均最高;皱盖疣柄牛肝菌多糖各组分均有不同程度的抑制HepG-2和MCF-7两种肿瘤细胞增殖的作用,在62.5～1000μg/mL范围内抗肿瘤活性与浓度成正相关;1000μg/mL的皱盖疣柄牛肝菌多糖的抗肿瘤活性随时间的增长而提高。但是多糖对于浓度的依赖性要高于时间的。其中抗肿瘤效果最好的是皱盖疣柄牛肝菌纯化多糖LR-III,与阳性对照5-氟尿嘧啶相当;皱盖疣柄牛肝菌多糖各组分均有不同程度的免疫调节活性。在62.5～1000μg/mL浓度范围内,皱盖疣柄牛肝菌多糖各组分对小鼠脾淋巴细胞增殖均有不同程度的促进作用,也可以激活小鼠巨噬细胞RAW264.7,增强细胞活力、吞噬中性红能力以及免疫因子NO、IL-6及TNF-α的分泌能力。其中浓度为1000μg/m L皱盖疣柄牛肝菌纯化多糖LR-III的免疫活性最高,与5μg/mL的阳性对照LPS相当。