表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌的预防作用及其相关机制研究

研究背景： 在我国结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率很高。随着我国的经济发展和人民生活水平的不断提高，生活方式及膳食结构的改变，结肠癌的发病率有逐年上升的趋势。烹调的肉类食品中存在多种杂环胺类(HGAs)致癌和致突变物，HCAs为存在于烤、焙肉和鱼中的基因毒化合物，人们几乎每天都暴露在诱变剂(或致癌剂)杂环胺类物质中。流行病学的研究表明，当人们摄入相对大量的过熟肉类时，罹患结直肠癌的风险显著升高。其中2-氨基3-甲基咪哗(4，5-f)喹啉(IQ)是杂环胺类中含量相对较多的一种，可以导致结肠肿瘤的基因突变和微卫星不稳定性，从而具有明显致癌作用。 虽然现在人们对结肠癌的的研究已经取得了很大的进展，但是始终不能改变其发病率高、死亡率高的现状。目前，由于食物的应用方便及无毒害等优点，饮食中的化学防癌物品成为人们研究的热点，如：姜黄素、莱菔子素、番茄素等。这些物质其化学预防的作用可能在于：一是有些植物化学成分能阻止人体内致癌物的形成：二是能激活细胞中的蛋白分子：从而把侵入人体细胞的致癌物质裹起来，并将致癌物排出体外，阻止了致癌物对细胞核的损伤，保证了基因的完好。三是能消灭癌症的初始病灶，抑制癌变区生长毛细血管，使癌变部位因缺氧和营养不足而萎缩死亡。四是能促进人体淋巴细胞的形成，淋巴细胞能参与机体围歼癌瘤的战斗。 茶的保健作用自古以来就有记载，茶多酚是茶叶中三十多种多酚类物质的总称，是一种从绿茶中提取的纯天然混合物，主要由四大类物质组成，其中以儿茶素最为重要，约占多酚类总量的60～80％，儿茶素类主要由表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)等几种单体组成，其中以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的含量最丰富。研究表明：EGCG在体内外通过多种信号途径抑制肿瘤细胞的增殖和促进其凋亡，也可以诱导肠道中的Ⅱ相代谢酶，从而起到预防肿瘤的作用。 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)是化学物质在体内生物转化第Ⅱ时相中最重要的代谢酶，能催化葡萄糖醛酸与多种化学物质进行葡萄糖醛酸结合反应，使其水溶性增加，从而随尿液和胆汁排出。虽然肝脏微粒体是葡萄糖醛酸结合反应的主要部位，但在胃肠道中可以特异地检测到UGT1A8及UGT1A10的表达。胃肠道的葡萄糖醛酸化反应是肝脏解毒反应的补充，发挥着胃肠道粘膜的代谢屏障作用。 核转录因子Nrf2，锌指蛋白转录因子家族成员之一，与代谢酶特别是Ⅱ相代谢酶的诱导有关。Ⅱ相代谢酶基因的诱导表达是由顺式作用抗氧化反应元件(ARE)或亲电子效应元件(EpRE)调控的。转录因子Nrf2结合到ARE／EpRE，并与小Maf蛋白之一形成异二聚体，从而调控转录作用。许多物质通过激活Nrf2来诱导UGT的表达，从而发挥化学保护作用的。 本研究探讨EGCG能否对致癌物IQ导致的免疫缺陷小鼠结肠粘膜隐窝畸变(ACF)、组织学改变具有保护作用，并分析Nrf2和UGT1A10的mRNA和蛋白表达的变化；再分别以HT-29结肠癌细胞和Nrf2低表达的HT-29结肠癌细胞，在裸鼠结肠原位建立肿瘤模型，不同剂量EGCG给裸鼠口饲，观察肿瘤组织的原位生长、远处转移、及肿瘤组织内的Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10的mRNA和蛋白表达的变化情况，从而分析EGCG预防结肠癌的相关机制。 研究目的： 1．观察不同浓度EGCG对致癌物IQ所诱导的裸鼠结肠粘膜ACF形成的影响，观察结肠病理形态改变，并分析Nrf2和UGT1A10的mRNA和蛋白表达的变化情况，从而探讨EGCG预防结肠癌前病变的可能分子机制。 2．首先建立裸鼠皮下HT-29结肠肿瘤模型，再利用皮下肿瘤组织，建立裸鼠结肠原位肿瘤模型，观察不同浓度EGCG对结肠肿瘤原位生长、腹膜转移、腹水形成、肝肺转移的抑制作用，分析肿瘤组织内Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10的mRNA和蛋白表达的变化情况，探讨EGCG是否通过诱导UGT1A及其同工酶的表达而起到预防结肠癌的原位生长与转移的作用。 3．体外封闭HT-29结肠癌细胞中Nrf2基因的表达，用低表达Nrf2基因的HT-29结肠癌细胞建立裸鼠皮下肿瘤模型，然后建立裸鼠结肠原位肿瘤模型，观察不同浓度EGCG对结肠肿瘤原位生长、腹膜转移、腹水形成、肝肺转移的抑制作用，分析肿瘤组织内Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10的mRNA和蛋白表达的变化情况，探讨Nrf2基因在EGCG诱导UGT1A及其同工酶的表达中的桥梁作用。 研究方法： 1．用致癌物IQ诱导裸鼠结肠粘膜隐窝发生畸变的动物模型，观察低、中、高剂量不同浓度EGCG(5，10和20mg／kg.d)预先作用于小鼠后，0.2％亚甲蓝染色观察ACF数目及畸变隐窝(AC)的数目，HE染色观察结肠粘膜组织的病理改变，免疫组化和Western-blotting检测结肠组织中Nrf2基因的蛋白表达水平，RT-PCR检测Nrf2和UGT1A10基因的mRNA表达水平，分析ACF的形成与Nrf2和UGT1A10基因表达间的关系。 2．体外常规培养HT-29结肠癌细胞至对数生长期，在裸鼠皮下建立肿瘤模型，反复传代5次，切下皮下肿瘤，建立裸鼠结肠原位肿瘤模型，观察低、中、高剂量不同浓度EGCG(5，10和20mg／kg.d)预先作用于小鼠后，肉眼观察有无腹膜转移、腹水形成，HE染色观察肝肺组织的病理学改变，免疫组化和Western-blotting检测大肠组织中Nrf2基因的蛋白表达水平，RT-PCR检测Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10基因的mRNA表达水平，分析不同剂量EGCG对裸鼠结肠原位生长和转移的抑制作用，及其对Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10基因的诱导表达作用。 3．利用RNA干扰技术封闭Nrf2基因的表达，建立低表达Nrf2基因的HT-29结肠癌细胞系，培养其至对数生长期，在裸鼠皮下建立肿瘤模型，反复传代5次，切下皮下肿瘤，建立裸鼠结肠原位肿瘤模型，观察低、中、高剂量不同浓度EGCG(5，10和20mg／kg.d)预先作用于小鼠后，肉眼观察有无腹膜转移、腹水形成，HE染色观察肝肺组织的病理学改变，免疫组化和Western-blotting检测肿瘤组织中Nrf2基因的蛋白表达水平，RT-PCR检测Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10基因的mRNA表达水平，分析不同剂量EGCG对裸鼠结肠原位生长和转移的抑制作用，反向验证Nrf2在不同剂量EGCG诱导UGT1A、UGT1A8和UGT1A10基因的诱导表达中的作用。 4．统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料的数据均以Means±SD表示，对成组设计的多个样本均数的比较，进行方差分析；计数资料的数据均以％表示，对所得计数资料进行卡方检验。P＜0.05为差异有显著性。 研究结果： 1．IQ处理组裸鼠的体重明显下降，结肠粘膜呈现高度不典型增生并形成大量ACF。不同浓度EGCG处理后，裸鼠体重明显上升，病理改变趋于正常，ACF数目明显下降，免疫组化和免疫印迹检测大肠组织Nrf2蛋白表达水平明显高于IQ组(P＜0.05)，且在免疫组化中发现Nrf2有核转录现象，RT-PCR检测Nrf2和UGT1A10的mRNA表达水平明显高于IQ组(P＜0.05)。 2．用HT-29结肠肿瘤细胞建立结肠原位肿瘤模型组的裸鼠有少数发生恶液质及消瘦的现象，不同剂量EGCG处理后，裸鼠体重上升，并明显抑制结肠原位肿瘤的生长及多处转移(腹膜、腹腔和肝肺)，免疫组化和免疫印迹检测肿瘤组织Nrf2基因的蛋白表达水平明显高于模型组(P＜0.05)，且在免疫组化中发现Nrf2有核转录现象，RT-PCR检测Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10基因的mRNA表达水平明显高于模型组(P＜0.05)。 3．用HT-29-siNrf2结肠肿瘤细胞建立结肠原位肿瘤的各组裸鼠，体重无明显差异，不同剂量EGCG处理后，并无明显抑制结肠原位肿瘤的生长及多处转移(腹膜、腹腔和肝肺)，免疫组化和免疫印迹检测肿瘤组织Nrf2基因的蛋白表达水平与模型组比较无明显差异(P＞0.05)，RT-PCR检测Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10基因的mRNA表达水平与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。 研究结论： 1．不同剂量EGCG能抑制IQ诱导的裸鼠结肠ACF的形成，进而预防结肠癌的发生，并且有剂量依赖效应，这种作用可能是通过诱导Nrf2和UGT1A10基因的表达，从而增加肠粘膜对IQ的清除，减少IQ诱导的ACF形成来实现的。 2．不同剂量EGCG能够抑制裸鼠HT-29结肠原位肿瘤的局部生长和远处转移，并且有剂量依赖效应，这种作用可能是通过诱导Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10基因的表达，从而增加肠粘膜对肿瘤组织的抵抗性(局部浸润和远处转移)。 3．与模型组(低表达Nrf2的结肠肿瘤细胞系建立的结肠原位肿瘤)相比，不同剂量EGCG对结肠原位肿瘤的局部生长和远处转移均无明显抑制作用，也并不能明显诱导Nrf2、UGT1A、UGT1A8和UGT1A10基因的表达，说明Nrf2在EGCG诱导UGT1A及其同工酶表达中起到关键作用。 研究意义： 1．本研究证实了不同剂量EGCG可以抑制IQ诱导的结肠ACF的形成，构建了结肠癌植物化学保护剂的动物模型，为结肠癌预防的体内研究奠定实验基础。 2．本研究证实了不同剂量EGCG可以抑制裸鼠结肠原位肿瘤的局部生长和多处转移，并且率先在结肠原位肿瘤模型中提出了EGCG可以诱导Nrf2-UGT1A信号通路中基因表达的作用，这为模拟人体内结肠肿瘤的生长、转移，探求结肠肿瘤的植物化学预防的新机制提供了实验依据。 3．本研究进一步从反面证实EGCG可以诱导UGT1A及其同工酶的表达，其中核转录因子Nrf2起到关键的桥梁作用，这为体内研究Nrf2基因参与代谢酶诱导的机制提供依据。