rhIL-1α、1，25-（OH）2D3对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的影响

骨代谢是由成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间构成的动态平衡过程,骨代谢平衡的维持不仅受很多调节因素如机械力﹑酶等作用,还受细胞本身活动的影响。在牙周组织中,参与牙槽骨改建的功能细胞除成骨细胞和破骨细胞外,还有一种特殊的细胞牙周膜细胞。牙周膜细胞是一组有异质性的细胞群,其中牙周膜成纤维细胞是牙周膜中最主要的细胞,研究证明其具有成骨细胞的许多特点,能表达多种细胞因子影响骨代谢活动。同成骨细胞一样,人牙周膜成纤维细胞可以通过表达破骨细胞分化因子（receptor activator nuclear factor kappa B ligand,RANKL）和骨保护因子（osteoprotegerin,OPG）来调节破骨细胞的活动。RANKL和OPG均由成骨细胞/成骨样细胞合成和分泌,RANKL是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）配体超家族成员,是一种跨膜蛋白,能与破骨细胞前体表面唯一的受体核因子-kB活化因子（receptor activator of nuclear factor-kappa B, RANK）结合,通过一系列酶促级联反应引起破骨细胞前体分化、增殖和成熟并激活破骨细胞使其从骨膜中释放、转移、粘附到骨质表面引起骨吸收,而OPG为TNF受体超家族成员,属于一种可溶性糖蛋白,是RANKL的天然诱饵受体,能竞争性地与RANKL结合,阻断RANK与RANKL的结合,从而抑制破骨细胞的生成、分化及其功能,抑制破骨细胞的骨吸收作用。RANKL/OPG的比值是骨代谢平衡的重要杠杆,骨微环境中RANKL与OPG表达量的相对比值决定着骨代谢的方向。 牙周膜细胞通过RANKL-RANK-OPG调节轴调节牙周膜细胞参与骨吸收活动,其代谢和功能并不是受单一因素的调节和影响。rhIL-1α及1,25-（OH）2D3都是骨代谢调节的重要因子,在牙槽骨改建过程中发挥重要作用。国内外研究表明rhIL-1α和1,25-（OH）2D3调节成骨细胞/基质细胞表达RANKL和OPG,影响RANKL/OPG比值,间接影响骨代谢平衡。本课题旨在探讨rhIL-1α及1,25-（OH）2D3对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的影响,进一步丰富我们对牙槽骨代谢和改建的认识。 本实验在体外培养人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts, HPDLFs）,鉴定细胞来源。并在转录和蛋白水平检测正常HPDLFs RANKL和OPG的表达,探讨HPDLFs参与调节牙槽骨改建的RANKL-OPG通路。初步探讨骨代谢调节因子rhIL-1α及1,25-（OH）2D3对HPDLFs表达RANKL和OPG的影响。本研究将实验分为以下两部分: 一、HPDLFs的体外培养与鉴定以及正常HPDLFs RANKL和OPG的表达 目的 （1）体外培养HPDLFs并鉴定细胞来源,为后续实验做好可靠的实验模型。 （2）分别从转录和蛋白水平观察正常HPDLFs RANKL和OPG的表达。 （3）探讨HPDLFs参与牙槽骨改建的RANKL/OPG通路。 方法 组织贴块法培养HPDLFs,免疫组化鉴定细胞来源。采用荧光定量RT-PCR法检测正常HPDLFs RANKL和OPG在转录水平的表达,同时使用免疫组化和ELISA法检测跨膜蛋白RANKL和分泌蛋白OPG的表达。 结果 （1）成功培养HPDLFs,细胞来源可靠。 （2）无论是转录还是蛋白水平HPDLFs都分泌和表达RANKL和OPG,并且OPG的表达强于RANKL的表达,以维持牙周膜内环境的稳定。 （3） HPDLFs通过RANKL-OPG通路参与调节牙槽骨改建。 结论 HPDLFs同成骨细胞一样,通过RANKL-OPG通路调节牙槽骨改建。在正常生理情况下,OPG的表达强于RANKL的表达,以维持牙周膜内环境的稳定。 二、rhIL-1α、1,25-（OH）2D3对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG的影响 目的 （1）探讨骨代谢调节因子rhIL-1α对HPDLFs表达RANKL和OPG的影响。 （2）初步探讨rhIL-1α与1,25-（OH）2D3联合作用对HPDLFs表达RANKL和OPG的影响,丰富我们对牙槽骨改建的认识。 方法 （1）用不同浓度rhIL-1α（0、5、10、20ng/ml）作用于体外培养的HPDLFs,于24h后收集细胞,利用荧光定量RT-PCR技术检测RANKL mRNA和OPG mRNA的表达。 （2） 10ng/ml rhIL-1α与1×10-8mol/L1,25-（OH）2D3联合作用于体外培养的HPDLFs,于48h后收集细胞,利用荧光定量RT-PCR技术检测RANKL mRNA和OPG mRNA的表达,探讨RANKL/OPG比值的变化。 结果 （1） HPDLFs在不同浓度rhIL-1α作用下RANKL和OPG mRNA的表达发生变化（F=48.870,P<0.05）。rhIL-1α不仅上调HPDLFs表达RANKL mRNA,还同时稳定上调OPG mRNA的表达,但其对RANKL mRNA的调节幅度要大于OPG,RANKL/OPG的比值增加,在10ng/ml的作用浓度时对RANKL/OPG比值影响最为明显,C组与B、D组比较均有统计学差异（P<0.05）。 （2） rhIL-1α和1,25-（OH）2D3都影响HPDLFs表达RANKL和OPG。rhIL-1α单独作用上调HPDLFs表达RANKL和OPG,增加RANKL/OPG比值（P<0.05）;而1,25-（OH）2D3单独作用则上调表达RANKL,下调表达OPG,增加RANKL/OPG比值（P<0.05）。这两种调节因子联合作用对HPDLFs RANKL表达有协同作用,但对RANKL/OPG比值的影响无协同效应（P>0.05）。 结论 （1） rhIL-1α与牙槽骨改建密切相关,rhIL-1α不仅上调HPDLFs表达RANKL mRNA,还同时稳定上调OPG mRNA的表达,但其对RANKL mRNA的调节幅度要大于OPG,RANKL/OPG的比值增加。 （2） rhIL-1α和1,25-（OH）2D3都通过RANKL-OPG途径调节HPDLFs参与牙槽骨改建,两种调节因子联合作用对RANKL表达的影响明显优于单因素诱导效果,但对RANKL/OPG比值的影响并没有产生协同效应或累加效应。