慢性应激肝郁证大鼠海马差异表达基因的初步研究

证候以中医藏象理论为基础，又指导着临床诊治的实施，因而成为近年来中医研究的热点。肝郁证是中医肝病的基础性证候，是临床常见的证候之一，具有重要的研究意义。研究显示，肝郁证可能是由负性心理应激导致高级神经中枢调节机制紊乱而形成的，涉及到神经、内分泌、循环、消化、免疫、感觉、运动等多系统多方面病理改变。作为一类复杂证候，肝郁证表现不仅涉及肝本身病变，也关系到全身其它多脏腑系统的复杂体系。目前对证候的研究只在某些层面上反映了部分已知基因表达产物(受体、酶、细胞因子以及肽类等)的改变，远未揭示肝郁证的实质。证候的复杂表现有其物质基础，而这种物质基础最终可能是由于基因水平上的调控发生紊乱。基于上述认识，本文主要从以下方面进行了初步研究： 1 理论研究 随着后基因组时代的来临，在生命科学的研究重点已经从结构基因组学开始转向功能基因组水平，这种更重视基因功能、更强调相互作用关系和整合的理念，与中医学的学术特征不谋而合。证候研究作为中医学发展的重点与核心，面对这种契机和趋势，提出证候基因组学概念非常必要。证候基因组学，是指在证候理论指导下，运用功能基因组学方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证时基因的变异及差异表达情况，揭示与某一证候形成相关的所有基因及其功能，从整体基因表达的水平阐明证候的本质。在此基础上，二者相互融合与渗透而产生的新学科，其深入研究有可能大力推动中医证候学的飞速发展，使之向一个更深层次迈进。因而，证候基因组学概念的提出是中医证候学研究要更加深入完善的必然发展要求。 2 实验研究 为了探讨肝郁证的基因变化的物质基础，本研究利用慢性温和不可预知应激肝郁证模型，取海马进行mRNA差异表达分析，目的是为了发现与肝郁证密切相关的基因片段，从而对肝郁证实质和机理进行研究。 动物实验分两批进行，均使用SD雄性大鼠。第一批用于进行基因差异表达的研究，为尽量消除个体间差异，特选取同窝出生的SD雄性大鼠(200-250克／只)6只，随机分为正常对照、应激模型、应激模型加阿米替林，每组2只。对照组2只群养，其他二组孤养。第二批大鼠用于进行Northern杂交的RNA转膜，共32只，随机分为四组，其中前三组每组各8只，与上述三组的分类、喂养、刺激、给药方法相同。第四组为模型+逍遥散组共8只：造模同模型组，将灌胃改为逍遥散(10ml／kg．浓度1.92g／ml)．孤养。两批饲养均在允许时自由摄取食水。 造模21天后，末次处理的24小时后，快速断头处死，冰上取脑，分离海马，液氮冻存备用。然后用Trizol试剂一步法提取模型大鼠海马总RNA。首先以GENOMYX公司的fluoroDD试剂盒，选取3’端锚定引物和5’端随机引物配合进行反转录(Reverse Translation)，然后以原引物对相互配合进行PCR反应。经荧光标记后，电泳分离出与空白对照组表达有差异的基因条带共18条。将这些差异条带小心回收并连接进入T-easy质粒DNA载体，然后转化进入大肠杆菌，经克隆后进行测序、登 ．4－慢性应激肝郁证大鼠海马差异表达基因的初步研究 陆和检索．相似性搜寻，结果显示，其中有5个片断经Genbank检索、分析与己知的 基因有相似性，它们是：2、3号条带与AF1633n，即大鼠中枢神经系统中的腹侧正 中线杭原（ventral midline antig。n，VEMA）的序列具有高度相似性，可能是该序 列的一部分，其所表达的蛋白可能在调节哺乳动物的轴突导向（regulating axon guidance）方面发挥重要作用；9号条带与大鼠 Palmitoyl 一prot。in thioest。ras。 硬P t）、4、10 号条带与大鼠异柠檬酸脱氢酶、12 号与大鼠唾液酸转移酶 9 （slalyltransferase 9）、8号与Hivnocamvus cDNA（AK013739）有高度相似性．其 余条带均未与己知基因有相似性，部分在GenBank数据库上进行的登陆，接受号分别 为：5号登陆号为B0543229；6号登陆号为BG412955；7号登陆号为BG874242；11 号的登陆号是BQ543228；13号的登陆号是BM958512；14号的登陆号是BM958511； 15号的登陆号是BM968513；16号未得至克隆；17号的登陆号是BM958510；18号登 陆号BQ258377；1号未登陆。 为了对差异显示的基因片段进行验证，我们又以32P同位素标记DNA探针，与海 马总RNA进行了Northern杂交，用以对上述差异表达结果进行验证。初步杂交结果 显示，6、15和 17号片段均为阳性，但未显示与 DDRT－PCR相同的组间差异，有待于 进一步的研究。 抑郁情绪和异常行为的发生作为肝郁证证候学研究的重要部分，其研究方式向来 重视宏观的行为观察和药效实验，而对于在基因组水平上的本质研究可以说仍有不少 空白，因而无法在根本上阐明肝郁证发生、发展的病理机制。能够代表某一特定时空 条件下基因表达变化的差异显示法（DDRT－PCR），用来研究证候学是很适合的工具， 但目前未见相关研究报道。本研究率先利用DDRT－PCR技术，研究肝郁证模型海马中 基因差异表达情况。发现肝郁证动物模型与正常动物在海马区基因表达谱存在差异， 并分离出 18个差异表达的 DNA条带，其中 3个片段