二氧化硅粉尘致肺纤维化机制及早期生物标记物研究

矽肺是吸入二氧化硅粉尘引起的以肺间质纤维化为主的全身性疾病。属于法定职业病。1991～2002年我国职业病发病总数呈现明显的凹形反弹趋势。发病人数从20世纪90年代初的每年2.2万人逐步下降，1997年最低降至1万人后又呈反弹，2002年达1.5万人，其中主要是尘肺检出率显著回升，发病形势依然严重。截至2002年，全国累计检出尘肺病58万余例，其中累计死亡近14万人，尘肺现患病人44万余例。尘肺病又以煤工尘肺、矽肺最为严重。而且，停止粉尘暴露，尘肺病依然进展；高浓度暴露，发病工龄缩短，发病年龄趋于年轻化，病情严重，死亡率高。据估算，尘肺病每年对国家造成的经济损失约90亿元人民币。2001年资料显示：全国约有600多万接触粉尘作业的工人，按照《职业病防治法》规定，每年应接受职业性健康检查的工人有400多万人。并且，随着经济的发展，大量农村务工人员参与了无防护措施的接尘工作中，接触粉尘作业的人群还在急剧上升。ILO和WHO共同提出全球消除矽肺计划，在2010年使矽肺的发病率显著降低，到2030年完全消除矽肺。我国是尘肺大国，尘肺病人数、接触粉尘作业人数都居世界首位。直至目前，矽肺的发病机理仍然不完全清楚，无早期诊断的特异性指标，也无特异性的治疗药物和方法。一经传统的后前位胸大片确诊，肺部病变已经无法逆转。足以说明，我国尘肺病防制工作任重而道远。因此，进一步探讨二氧化硅粉尘致肺纤维化机制以及寻找早期诊断（筛检）特异性的生物标记物，对预防、治疗乃至最终消除矽肺具有重要意义。 研究目的 本研究从整体和细胞水平研究二氧化硅粉尘致肺纤维化过程中，转化生长因子-β1、肿瘤坏死因子-α、诱导性一氧化氮合酶、核因子-κB等细胞因子的表达和对肺细胞外基质中Ⅰ、Ⅲ型胶原异常合成的调控；从整体水平研究二氧化硅粉尘导致细胞凋亡及其机制；从蛋白质水平研究肺纤维化早期诊断（筛检）的蛋白质指纹图谱和生物标记物。进一步阐明二氧化硅粉尘致肺纤维化的机制，以及探讨矽肺的早期诊断（筛检）和治疗的新方法。 研究方法 随机将Wistar大鼠分为2个实验组，即对照组、染矽尘组。气管暴露注入二氧化硅粉尘悬液建立大鼠矽肺模型。模型建立后，分6个时间点（1d、3d、7d、14d、21d、28d），每组分别取8只大鼠将其处死。（1）利用组织芯片微阵列技术，采用免疫组织化学－SP法，从整体水平观察转化生长因子－β1、肿瘤坏死因子－α、诱导性一氧化氮合酶、核因子－κB细胞因子和Fas配体在大鼠矽肺模型肺组织的表达；采用天狼猩红染色法观察肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的异常合成，TUNEL方法观察二氧化硅粉尘所致细胞凋亡。采用Image-Pro Plus Version 4.5 for Wondowstm图像分析系统并利用图像分割原理，计算细胞因子阳性细胞的积分光密度和Ⅰ、Ⅲ型胶原的面积百分比，进行定量分析。（2）采用体外细胞培养技术，利用RT-PCR和ELISA方法观察二氧化硅粉尘诱导人单核细胞株(THP-1) TGF-β1mRNA、TNF－αmRNA、iNOSmRNA的表达及其TGF-β1、TNF－α、iNOS蛋白的表达。（3）采用SELDI-TOF-MS技术，探讨矽肺动物模型早期肺组织和SARS康复人员合并肺纤维化和股骨头缺血性坏死后遗症血清蛋白质指纹图谱和表达有差异的小分子生物标记物。（4）采用数学原理，初步探讨染二氧化硅粉尘后，单个细胞因子与Ⅰ、Ⅲ型胶原随时间变化的数学模型，以及多个细胞因子与Ⅰ、Ⅲ型胶原随时间变化的数学模型。 研究结果 1．HE染色法证实气管暴露注入二氧化硅粉尘悬液建立大鼠矽肺模型是成功的。 2．大鼠矽肺模型肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原随染尘时间延长而升高。与对照组比较，Ⅰ型胶原第7d、第14 d、第21 d和第28 d时显著升高，差异有显著性（P＜0.05），第28天时，Ⅰ型胶原面积百分比增加了近1倍；Ⅲ型胶原第1 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d时，均有升高，与对照组比较，除了第1 d外，其它各组间差异均有显著性（P＜0.05）。第28天时，矽尘组Ⅲ型胶原面积百分比明显高于对照组（P＜0.01）。 3．大鼠矽肺模型肺组织iNOS蛋白表达在第3 d、第7d显著高于对照组（P＜0.05），从21d开始到28d时，染矽尘组iNOS积分光密度反而低于对照组，其中28d显著低于对照组，有统计学差异（P＜0.01）。大鼠矽肺模型肺组织iNOS表达高峰是染矽尘后的第7d。 4．大鼠矽肺模型肺组织TGF-β1在染矽尘后的7 d、14 d 、21d和28 d时，显著高于对照组，差异有显著性（P＜0.05），表达高峰是染矽尘后的第7d。 5．大鼠矽肺模型肺组织TNF-α在染矽尘后的7 d、14 d 、21d和28 d时，显著高于对照组，差异有显著性（P＜0.05），表达高峰是染矽尘后的第21d。 6．大鼠矽肺模型肺组织NF-κB在染矽尘后的7 d、14 d 、21 d和28 d时，显著高于对照组，差异有显著性（P＜0.05），表达高峰是染矽尘后的第14d。 7．大鼠矽肺模型肺组织Fas-L在染矽尘后的7 d、14 d 、21 d和28 d时，显著高于对照组，差异有显著性（P＜0.05），表达高峰是染矽尘后的第14d。 8．大鼠矽肺模型肺组织凋亡阳性细胞在染矽尘后的1 d、3 d、7 d、14 d 、21 d和28 d时，显著高于对照组，差异有显著性（P＜0.05），凋亡高峰是染矽尘后的第7 d～14d。 9．二氧化硅粉