黄芩素改善线粒体功能、增强白癜风黑素细胞抗氧化应激能力的作用和机制研究

白癜风是常见慢性皮肤及黏膜色素脱失性疾病,患者约占世界人口的0.5-1%,约50%的患者在20岁前发病。皮肤白斑虽然无自觉不适,但严重危害患者的心理健康,尤其是青少年和青年,造成患者自卑、孤僻等。白癜风的发病机制尚未得以充分阐明。基于自身免疫学说,临床上外用糖皮质激素、免疫调节剂,以及NB-UVB照射等治疗白癜风,可获一定的治疗效果。但是这些治疗手段对于预防白癜风的复发以及对进展期白癜风的治疗明显不足。一般认为自身免疫只是出现在该病黑素细胞损害的效应阶段,激活和引发自身免疫的具体机制仍不明确。近年来,氧化应激学说得到普遍关注,并得到一系列实验结果的支持。抗氧化剂治疗白癜风也在临床上进行了一些尝试。线粒体是细胞内ROS产生的主要部位,正常情况下其具有完善的抗氧化体系,当线粒体功能障碍时出现细胞内ROS堆积,导致线粒体损伤。研究发现,白癜风患者皮损处(角质形成细胞)和皮损周(黑素细胞及角质形成细胞)细胞线粒体超微结构损害,进一步支持氧化应激致病学说。黄芩素(Baicalein,BE)是从植物黄芩的根中提取的黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗细菌等作用。我们课题组前期研究证实,BE通过抑制p38MAPK通路对抗正常人黑素细胞系(PIG1)氧化应激损伤,另外BE减少Cyt C释放,通过抑制线粒体凋亡途径保护PIG1细胞,但是具体机制尚不明确。核因子E2相关转录因子2(Nrf2)是细胞内重要的抗氧化转录因子,上调Nrf2可以提高黑素细胞抗氧化应激的能力,诱导HO-1是Nrf2的作用机制之一。在白癜风患者黑素细胞系(PIG3V)中BE是否具有提高细胞抵抗氧化应激损伤能力,改善线粒体功能障碍的作用?其发挥作用的具体机制又是是什么?Nrf2提高黑素细胞抗氧化能力是否存在其他机制?为了解决以上问题,我们提出了如下假说:BE通过激活Nrf2-NRF1-TFAM通路,发挥改善线粒体功能障碍、促进线粒体生物合成,从而增强黑素细胞抗氧应激损伤能力。本研究以PIG3V细胞为研究对象,在细胞水平观察BE改善线粒体功能障碍、促进线粒体生物合成和增强细胞抗氧化能力的作用并对其机制进行初步探究,为阐明BE的抗氧化机制提供新思路,为其用于白癜风的临床治疗奠定理论基础。研究内容1.BE对氧化应激下PIG3V细胞形态、存活率以及线粒体超微结构、功能和生物合成的影响;2.BE对于Nrf2以及线粒体合成相关基因的影响;3.过表达Nrf2对线粒体生物合成及功能的影响。研究方案1.建立PIG3V细胞氧化应激模型,观察BE预处理的保护作用。实验分组及处理条件:对照组:黑素细胞培养基;BE组:40μM/L BE处理1h,其后换用黑素细胞培养基处理;H2O2组,0.75 m M/L H2O2处理;BE+H2O2组;40μM/L BE处理1h,其后换用0.75 m M/L H2O2处理。显微镜下观察BE对PIG3V细胞的保护作用;CCK-8法检测细胞存活率;电镜观察线粒体超微结构变化;MTT法检测线粒体活性;ENLITEN®ATP检测试剂盒检测ATP水平;流式细胞术检测线粒体膜电位和细胞内ROS;Real-time PCR(RT-PCR)检测线粒体DNA(mt DNA)拷贝数。2.蛋白免疫印迹检测BE对PIG3V细胞Nrf2及线粒体合成相关蛋白(NRF1、TFAM)的影响;3.采用Nrf2过表达质粒瞬时转染PIG3V细胞,建立Nrf2过表达模型,观察过表达Nrf2对线粒体生物合成和功能的影响。荧光显微镜观察和蛋白免疫印迹确认过表达模型是否构建成功;ENLITEN®ATP检测试剂盒检测ATP产量;流式细胞术检测MMP;RT-PCR、蛋白免疫印迹检测线粒体合成相关基因的m RNA和蛋白水平;RT-PCR检测mt DNA拷贝数。结果1.形态学观察、细胞存活率检测显示BE保护氧化应激下PIG3V细胞,提高其抵抗氧化应激损伤的能力;2.BE减轻氧化应激下PIG3V细胞线粒体超微结构的损害;3.BE改善氧化应激下PIG3V细胞线粒体功能障碍:增强线粒体活性、提高MMP、促进ATP生成、降低细胞内ROS水平;4.BE促进氧化应激下PIG3V细胞线粒体生物合成;5.BE上调Nrf2通路,促进PIG3V细胞线粒体生物合成相关蛋白(NRF1、TFAM)表达;6.过表达Nrf2改善线粒体功能:提高线粒体膜电位、促进ATP生成;7.过表达Nrf2促进线粒体合成:线粒体生物合成相关(NRF1、TFAM)m RNA、蛋白水平升高;mt DNA拷贝数增加。结论1.在PGI3V细胞中,BE可改善氧化应激导致的线粒体功能障碍,促进线粒体生物合成,提高细胞抗氧化应激能力;2.BE通过上调Nrf2通路,促进NRF1、TFAM高表达,改善PIG3V细胞线粒体功能障碍,促进线粒体生物合成,保护氧化应激下的黑素细胞。