人胰腺癌SW1990细胞高肝转移细胞系的建立及中药干预研究

背景：肝转移在晚期胰腺癌中十分常见，肝转移发生率达50％以上，尚无有效的治疗手段。胰腺癌肝转移是一个复杂的过程，建立胰腺癌肝转移模型是研究肝转移机理和抗肝转移药物筛选的关键。Vezeridis采用体内连续筛选法从人胰腺癌细胞株COL0357中成功分离并建立了高肝转移特性的人胰腺癌细胞系L3.5。Shishido采用体内连续筛选法从人胰腺癌细胞株HPC-3中成功分离并建立了高肝转移特性的人胰腺癌细胞系HPC-3H4。这两株细胞都有中位观察时间长，转移灶数量少的缺点。国内尚无胰腺癌高肝转移细胞株报道，人胰腺癌高肝转移细胞系的建立对胰腺癌肝转移机理研究和中药抗胰腺癌肝转移的筛选意义重大。 目的：拟建立具有高肝转移特性的人胰腺癌SW1990细胞系和构建胰腺癌肝转移裸鼠模型，并采用我院常用胰腺癌治疗中药清胰化积方和华蟾素进行干预研究及了解其稳定性和可靠性。 方法： 第一部分人胰腺癌SW1990高肝转移细胞系的建立 采用人胰腺癌细胞株SW1990构建裸鼠脾脏移植瘤肝转移模型，连续进行6轮肝转移筛选，取其肝转移灶建立具有高肝转移特性的人胰腺癌细胞系（SW1990HM）；并运用CCK8、流式细胞仪检测技术、Transwell、PCR、转移相关基因PCR芯片及高通量抗体芯片等方法进行该细胞系和原代细胞SW1990之间的差异研究。 第二部分中药对荷胰腺癌SW1990HM肝转移裸鼠模型的干预研究 1．清胰化积方对荷胰腺癌SW1990HM肝转移裸鼠模型的干预 采用SW1990HM脾内注射建立胰腺癌肝转移裸小鼠模型，随机分组生理盐水对照组、清胰化积方高剂量组、清胰化积方中剂量组、清胰化积方低剂量组、健择组五组，生理盐水对照组胃饲生理盐水0.4 ml d1-28和腹腔注射生理盐水0.2mld1、5、9，清胰化积方高、中、低剂量三组分别胃饲清胰化积方0.4 ml d1-28和腹腔注射生理盐水0.2ml d1、5、9；健择组腹腔注射健择0.2ml d1、5、9和胃饲生理盐水0.4ml d1-28。实验结束处死裸小鼠，解剖裸小鼠取出脾脏和肝脏，称取脾脏瘤重，计算抑瘤率；观察肝转移灶数，最后，免疫组化定量分析检测MMP-2、VEGF。 2．华蟾素对荷胰腺癌SW1990HM肝转移裸鼠模型的干预 采用SW1990HM脾内注射建立胰腺癌肝转移裸小鼠模型，造模后次日随机分组并给药，共五组：生理盐水对照组、华蟾素50g／kg组（大剂量组）、华蟾素25g／kg组（中剂量组）、华蟾素12.5g／kg组（小剂量组），健择组（120mg／kg）。生理盐水对照组腹腔注射生理盐水0.2ml d1-28，华蟾素高、中、低剂量三组分别腹腔注射华蟾素0.2ml d1-28；健择组腹腔注射健择0.2ml d1、5、9。实验结束处死裸小鼠，解剖裸小鼠取出脾脏和肝脏，称取脾脏瘤重，计算抑瘤率；观察肝转移灶数，最后，免疫组化定量分析检测MMP-2、VEGF。 结果： （1） SW1990HM细胞呈圆梭型，异常核分裂相多；细胞倍增时间缩短至56小时，较源细胞（64小时）增殖速度显著加快（P＜0.05）；S期细胞所占的比例为36.76％，比原代细胞31.89％显著增高（P＜0.05）；细胞的侵袭能力比源细胞提高（P＜0.05）；尽管两株细胞的成瘤率均为100％，但SW1990细胞的4周肝转移率为40％，而SW1990HM细胞为100％（P＜0.05）；6周时，SW1990HM细胞和源细胞的肝转移灶中位数分别为36个／肝和9个／肝（P＜0.05）；PCR检测显示，SW1990HM细胞MMP-2、VEGF、bFGF和E-cadherin mRNA表达水平均高于SW1990，只有MMP-9 mRNA表达水平低于SW1990；转移相关基因PCR芯片检测显示，有59种转移相关基因的表达发生改变；高通量抗体芯片检测显示，有40种蛋白的表达发生改变。 （2）经体内实验证实：清胰化积方高、中、低剂量组抑瘤率分别为21.59％、44.87％和20.63％，清胰化积方中剂量组明显高于对照组（p＜0.05），清胰化积方抑制脾脏移植瘤生长，无剂量效应关系；清胰化积方高、中、低剂量组肝转移抑制率分别为35.29％、52.94％和29.41％，清胰化积方中剂量组明显高于对照组（p＜0.05），显示清胰化积方具有较好的抗肝转移效果，无剂量效应关系。肝转移灶瘤组织免疫组化检测结果显示：①清胰化积方高、中、低剂量组MMP-2免疫组化指数明显低于对照组，差异显著（p＜0.05）；②清胰化积方高、中剂量组VEGF免疫组化指数与对照组比较差异显著（p＜0.05）；清胰化积方低剂量组免疫组化指数为对照组比较无差异显著（p＞0.05）； 经体内实验证实：华蟾素高、中、低剂量组抑瘤率分别为55.16％、21.63％和12.56％，华蟾素高剂量组明显高于对照组（p＜0.05），华蟾素可抑制脾脏移植瘤生长，有剂量效应关系；华蟾素高、中、低剂量组肝转移抑制率分别为47.06％、35.29％和23.52％，华蟾素高剂量组明显高于对照组（p＜0.05），显示华蟾素具有较好的抗肝转移效果，有剂量效应关系。肝转移灶瘤组织原位杂交检测结果显示：①华蟾素高、中、低剂量组MMP-2免疫组化指数与对照组比较差异显著（p＜0.05）。②华蟾素高、中剂量组VEGF免疫组化指数与对照组比较差异显著（p＜0.05）；华蟾素低剂量组免疫组化指数为对照组比较无差异显著（p＞0.05）。 结论： （1）SW1990HM是人胰腺癌高肝转移细胞系，由其构建的肝转移裸鼠模型是研究胰腺癌肝转移机制和抗肝转移治疗药物筛选良好的动物模型。转移相关基因及蛋白的变化有望用于研究胰腺癌肝转移和抗肝转移药物的分子靶点。 （2）清胰化积方和华蟾素可明显抑制脾脏移植瘤生长。使肝转移灶数量减少。进一步研究发现降低肝脏转移灶组织MMP-2、VEGF表达，是清胰化积方和华蟾素抗肝转移可能机制之一。提示人胰腺癌SW1990HM肝转移动物模型的建立将来有助于抗肝转移中药的筛选研究。