自噬对骨质疏松间充质干细胞成骨分化能力的影响

原发性骨质疏松(osteoporosis,OP)作为一种与年龄密切相关的骨代谢疾病,在人口日益老龄化的当今社会发病率逐年增高。骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture,OF)是其最为严重的并发症,老年人遭受骨折后常常因为疼痛和功能障碍,从而丧失自理能力,其高致残率和高死亡率,使得OP逐渐成为一个严重的公共健康问题。在所有OF中,发生在脊柱的骨质疏松性椎体压缩骨折(osteoporotic vertebral compression fracture,OVCF)最为常见。因为衰老而导致成骨能力不足是OP的主要发病机制,自噬是细胞实现自我稳定的重要生理机制,近年来研究表明自噬对间充质干细胞自我更新和分化有着重要的调控意义。但自噬能否提高骨质疏松机体中的骨间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力目前仍不清楚。本课题以源自骨质疏松椎体的BMSCs作为研究对象,从以下四方面探讨自噬对BMSCs成骨分化能力的影响,以期为OP的治疗提供新的思路。第一部分人BMSCs衰老表型的比较目的比较老年骨质疏松和年轻人椎体中BMSCs的衰老表型。方法选取10名在我科住院接受椎体切除术的男性患者。其中5名为老年患者,被诊断为原发性老年骨质疏松症(OP组);另5名为年轻患者,受伤前未有脊柱疾患医疗病史(正常对照组)。签署知情同意书后,手术摘取患者的伤椎,常规提取、培养BMSCs,取原代细胞做后续检测。β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老表型,western blot检测衰老相关基因P53和P21蛋白表达,ELISA法检测端粒酶活性。结果SA-β-gal染色阳性的细胞比例在OP组明显增高(P﹤0.05),且衰老相关基因P53和P21的蛋白表达也较正常对照组显著提高(P﹤0.05),此外ELISA结果显示OP组中BMSCs的端粒酶活性明显下降(P﹤0.05)。结论来自老年骨质疏松患者的BMSCs具有更明显的衰老表型。第二部分人BMSCs自噬水平和成骨分化能力比较目的比较老年骨质疏松和健康成年人椎体中BMSCs自噬水平和成骨分化能力。方法取第一部分培养的两组BMSCs细胞,western blot检测自噬相关基因LC3和P62蛋白表达;转染含LC3-GFP质粒的腺病毒后,激光共聚焦下观察代表自噬体的绿色荧光斑点数。细胞经成骨诱导分化培养基刺激后,碱性磷酸酶染色比较早期成骨指标,茜素红染色比较晚期成骨指标钙盐沉积的影响。荧光定量PCR(q-PCR)检测骨形成相关基因I(collagen type I,COL I)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)以及Runt相关转录因子2(RUNX2)。结果Western blot结果显示OP组BMSCs的LC3-II/I表达明显降低,而P62表达明显增高(P﹤0.05);激光共聚焦观察进一步证实OP组中绿色荧光斑点数目显著下降,说明细胞内自噬体数目减少(P﹤0.05)。两组BMSCs经成骨诱导后,茜素红和碱性磷酸酶染色发现OP组阳性程度明显弱于正常对照组,而q-PCR结果显示成骨分化的一些关键指标COL I、OCN、OPN和RUNX2在OP组中均显著下降,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。结论骨质疏松的BMSCs中自噬水平较正常细胞低,且成骨分化能力更弱。第三部分自噬促进骨质疏松BMSCs的体外成骨分化目的探讨自噬对骨质疏松性BMSCs成骨分化能力影响。方法取第一部分OP组培养的BMSCs,分别给予自噬的抑制剂3-MA和激动剂雷帕霉素(RAP)预处理2h,western blot和激光共聚焦检测处理后的自噬水平。再经成骨诱导分化培养基刺激后,茜素红和碱性磷酸酶染色比较成骨分化效果;q-PCR检测自噬调控后的成果分化关键指标COL I、OCN、OPN和RUNX2。结果Western blot和激光共聚焦均证明在与对照组的比较中,3-MA预处理后BMSCs的自噬水平明显降低,而RAP则显著提高了其自噬水平(P﹤0.05)。经自噬调控后,BMSCs的成骨分化能力也发生了明显改变,3-MA抑制自噬后碱性磷酸酶染色阳性程度明显降低,茜素红染色显示的矿化结节也明显减少(P﹤0.05);而RAP提高自噬水平后,茜素红和碱性磷酸酶的阳性程度均明显强于对照组(P﹤0.05);q-PCR结果进一步显示COL I、OCN、OPN和RUNX2表达在3-MA组中表达明显下降,而在RAP组中则显著上升,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。结论自噬对骨质疏松BMSCs的成骨分化有着重要影响,提高自噬可以促进其成骨分化能力。第四部分动物实验体内验证自噬的促成骨分化能力目的在裸鼠体内验证自噬对骨质疏松BMSCs的成骨分化影响。方法将3-MA和RAP预处理过的BMSCs常规接种于裸鼠皮下,行异位成骨实验,比较其在体内的异位成骨活性。种植8周后处死裸鼠,取出骨块测量其体积;micro-CT测定兴趣区体积(volume of interest,VOI),即骨组织体积与总的组织体积之比。再将余下组织常规石蜡包埋,组织切片后行HE和Masson染色,观察比较成骨情况。结果经RAP预处理的BMSCs皮下成骨骨块体积明显大于对照组,而3-MA组的骨块体积明显减小,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。Micro-CT检测进一步证明在与对照组比较发现,RAP组VOI值明显增高,而3-MA组VOI显著降低,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。通过HE、Masson染色发现RAP组的骨块比3-MA组的成熟度高,产生的类骨质更为丰富。结论药物提高BMSCs自噬水平可以促进其体内成骨能力,为OP的治疗提供了新的思路。