Stat5径路调控胆盐转运子Ntcp和Bsep表达及促胆盐转运的实验研究

一、研究背景 胆酸（盐）是肝脏分泌到胆汁中最大量的有机酸,是胆汁的主要成分。梗阻性黄疸（obstructivejaundice,OJ）时高胆酸（盐）血症会引发肠道细菌移位和内毒素血症,后者又可进一步诱导机体免疫功能障碍、胃肠道黏膜损伤、凝血机制紊乱甚至急性肾功能衰竭,从而形成恶性循环,病死率亦居高不下。临床上亦有部分重度OJ患者即使在胆道梗阻解除后黄疸消退仍缓慢甚或发生严重并发症。因此深入研究胆道梗阻及再通后病理生理改变的分子机制,对临床如何增强长期重度OJ患者的手术耐受性、提高手术安全性、促进术后的恢复具有重要意义。 近年来,具有肝组织特异性的胆盐转运子越来越受到人们的关注。钠-牛磺胆酸盐共转运多肽（Na+-taurocholate cotransporting polypeptide,Ntcp）和胆盐输出泵（bile saltexport pump,Bsep）是分别位于肝细胞膜血窦面和毛细胆管面上介导胆酸（盐）依赖ATP进行代谢的膜糖蛋白,两者的表达和/或功能异常是导致各种胆汁淤积症的根本因素。我们曾研究证实重组人生长激素（recombinant human growth hormone,rhGH）能明显促进大鼠肝细胞对胆红素的代谢,但其对胆盐转运的影响如何尚不清楚。 生长激素与生长激素受体（growth hormone receptor,GHR）结合引起信号转导与转录活化因子5（signal transducer and activator oftranscription 5,STAT5）径路活化是GH发挥效应的最主要途径。肝脏是人体内GHR含量最多的器官,既往在对OJ大鼠肝再生与GH/GHR轴关系的研究中发现,OJ大鼠存在GH分泌不足和GHR表达下降,相应的Stat5活性下调。我们推测,外源性补充rhGH能通过上调肝细胞胞浆内Stat5活性,后者移位至细胞核内与靶序列结合,进而调控Ntcp和Bsep基因表达,起到促进胆盐代谢的效应。 二、目的 本研究拟通过建立胆道梗阻-再通大鼠模型,观察Ntcp和Bsep在胆道梗阻.再通大鼠肝组织中的表达变化,以及rhGH对Ntcp和Bsep表达的影响,结合肝组织Stat5表达水平及功能活性,探讨GH/GHR-Stat5径路调控胆酸（盐）代谢的分子机制,为临床上防治梗阻性黄疸及其严重并发症、促进术后恢复提供新的思路。 三、方法与结果 1、重组人生长激素在胆道梗阻.再通大鼠中的应用价值:大鼠被随机分为A组（假手术组）、B组（胆道梗阻-再通-NaCl注射组）及C组（胆道梗阻-再通-rhGH注射组）,B组术后14d大鼠累积病死率为41.9%（13/31）,与C组14.3%（3/21）相比,差异具有统计学意义（χ2=4.493,P=0.034）。给予rhGH的C组大鼠血清学各项指标（ALT、TBIL、TBA和TNF-α）的改善明显优于0.9%NaCl注射的B组,随用药天数的增加,效果更趋明显,特别是在Pst14d时ALT和TNF-α水平已回落至A组水平,并显著低于B组（P＜0.05）。应用透射电镜观察肝组织超微结构改变,结果显示C组肝细胞线粒体肿胀、毛细胆管扩张以及单位面积微绒毛数量减少均较B组减轻,至Pst14d时肝细胞及毛细胆管形态恢复较好,微绒毛数量明显增加。 2、胆盐转运子Ntcp和Bsep在胆道梗阻.再通大鼠中的表达和意义:采用免疫组织化学、逆转录PCR及Western blotting等技术分别在肝细胞膜上定位、基因转录及蛋白翻译等水平上检测Ntcp和Bsep的表达情况以及rhGH对Ntcp和Bsep表达的影响。结果显示:CBDL术后Ntcp与Bsep mRNA及蛋白表达即明显减弱（P＜0.05）,Pst7d降至最低,BDR术后两者的表达缓慢增加,至Pstl4d时仍未恢复至A组水平（P＜0.05）。各时相点下C组大鼠肝组织中两种转运子的表达水平高于B组。 3、rhGH活化Stat5径路对胆盐转运子Ntcp和Bsep的调控机制研究:采用肝组织切片原位杂交（in situ hybridization,ISH）和电泳迁移率变动分析(electrophoreticmobility shift assay,EMSAl检测Stat5 mRNA表达水平以及Stat5与靶序列的结合能力,从不同层面探讨Stat5表达以及功能活性变化的规律。结果显示:胆道梗阻在很大程度上抑制了Stat5的表达和功能,在该模型中Stat5的转录水平以及与靶序列结合活性同样呈现出先下降再缓慢上升的变化趋势,rhGH能部分维护Stat5径路的功能活性。 四、结论 1、rhGH的应用能增强OJ大鼠进行胆道再通手术的耐受性、提高安全性,并促进术后的恢复,具有“利胆”和改善肝功能的有益效应; 2、胆道梗阻时Ntcp和Bsep表达均明显下调,胆道再通后缓慢恢复,尤其是Bsep恢复得更为缓慢,这可能是重度OJ患者术后血清胆盐水平下降迟缓、恢复不容乐观的主要原因之一; 3、rhGH能通过上调Ntcp和Bsep表达,增加肝细胞对胆盐的摄取和排泌,促进胆道再通后胆盐转运系统功能的恢复; 4、胆道梗阻抑制了Stat5的表达和功能,与梗阻期间GH/GHR轴活性下调有关,并且在胆道梗阻解除早期亦不能较快恢复,rhGH部分维护了Stat5径路的功能活性。