MicroRNA-451介导的HMGB1对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

背景： 急性心肌梗死已成为心血管疾病中发病率及病死率均高的疾病之一。目前最普遍的AMI治疗原则为实现闭塞血管的再通,拯救缺血边缘区心肌。然而再灌注治疗不可避免产生缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI),因此寻找安全,有效的细胞保护剂减轻IRI损伤为临床治疗的另一重点。 高迁移率族蛋白1(high mobility group box1protein, HMGB1)作为一种关键的新型促炎因子在多种心血管疾病发生和发展过程中具有重要作用,在心脏IRI相关研究中发现,HMGB1可通过促进炎性因子如TNF-α, IL-1的释放及相互作用致使组织损伤及细胞凋亡,因此明确I/R时HMGB1上调的关键因素及寻找调控HMGB1表达的关键基因可为阐明IRI提供新的理论基础及防治新思路。微小RNA(microRNA, miRNA)为一类长度约22nt的小分子非编码RNA,可在转录水平,转录后水平或表观遗传水平通过序列的互补配对结合对特定靶基因表达进行调控,目前研究提示多个miRNA参与缺血再灌注过程,因此寻找调控HMGB1表达的关键miRNA可为阐明HMGB1的上调机制及寻找新的内源性细胞保护剂提供重要思路。 通过预测软件Targetscan我们发现HMGB1可能为miR-451的靶基因,而近年来研究显示miR-451可通过减少细胞凋亡,氧自由基损伤及炎性反应多方面对I/R心肌提供保护。目前尚未有对miR-451调控的HMGB1对心肌IRI的作用及机制的相关研究。因此,本研究以重组腺病毒作为载体将大鼠niR-451(Ad-miR-451)及反义：miR-451(Ad-anti-sense strand miR-451, Ad-asmiR-451)转染至原代培养大鼠心肌细胞以及成年大鼠心肌组织中,建立大鼠心肌细胞缺氧再复氧模型以及心肌缺血再灌注动物模型以探讨以下问题：1.miR-451是否为调节心肌缺血再灌注后HMGB1表达的关键miRNA;2.上调miR-451能否在缺血再灌注大鼠模型中提供保护作用,为内源性防治IRI提供理论基础和实验依据。 方法： 1.构建携带pre-miR-451和asmiR-451穿梭质粒,将其与线性化的骨架质粒在大肠杆菌菌株DH5α中进行同源重组后在HEK293细胞中进行腺病毒包装形成Ad-miR-451和Ad-asmiR-451,经扩增、纯化获得滴度达到体内外实验要求的病毒液。 2.细胞实验：培养乳鼠原代心肌细胞,建立细胞缺氧再复氧损伤模型,转染目的miR后使用流式细胞仪测定细胞中病毒转染效率,台盼蓝染色检测细胞存活率,流式细胞仪检测凋亡率,SOD活性,免疫荧光检测HMGB1分布,Western Blot法检测细胞中HMGB1含量,凋亡通路关键因子Caspase3活化片段含量,Real-TimePCR法测定细胞中miR-451和HMGB1mRNA含量,双荧光酶素法进行miR-451调控HMGB1的靶点验证。 3.动物实验：将60只SD大鼠随机分为5组：假手术对照组(Control组)、缺血再灌注组(I/R组)、腺病毒空载体组(I/R+Ad-GFP组)、miR-451上调组(I/R+Ad-miR-451组)、miR-451下调组(I/R+Ad-asmiR-451组),每组12只。进行病毒液心肌注射(1×1010pfu/只)后3天建立缺血30min再灌注24h的I/R模型。测定心肌组织病毒转染效率,TTC+EVAN'S Blue法测定各组心肌梗死面积比,HE染色观察炎性浸润、TUNEL法检测凋亡率,抽取血清检测CK, LDH含量,心肌组织测SOD、MDA含量,WB法测定HMGB1和Caspase3活化片段含量,Real-TimePCR法测定miR-451和HMGB1mRNA含量。 结果： 1.成功构建出Ad-miR-451和Ad-asmiR-451重组腺病毒,经扩增纯化获得病毒滴度约为3×101pfu/ml; 2.1细胞实验：与Control组相比,A/R组和A/R+Ad-GFP组心肌细胞存活率下降,凋亡率上升,SOD活性下降,HMGB1从胞核向胞质转移,HMGB1mRNA及蛋白含量、Caspase-3活化片段蛋白含量上升,miR-451表达下降(以上P<0.05)；与A/R组和A/R+Ad-GFP组相比,A/R+Ad-miR-451组心肌细胞存活率上升,凋亡率下降,SOD活性上升,HMGB1从胞核向胞质转移减少,HMGB1mRNA及蛋白含量、Caspase-3活化片段蛋白含量下降,miR-451表达上升(以上P<0.05)；与A/R组和V/R+Ad-GFP组相比,A/R+Ad-asmiR-451组心肌细胞对心肌细胞存活率、SOD活性、HMGB1的含量与分布及Caspase-3活化片段蛋白含量、miR-451表达无改善(以上P>0.05)。 3.动物实验：与Control组相比,I/R组和I/R+Ad-GFP组心肌组织炎性浸润明显,细胞凋亡率增加,血清CK、LDH含量上升,心肌组织SOD活性下降,MDA含量上升,心肌组织HMGB1mRNA和蛋白含量,Caspase-3活化片段蛋白含量上升,miR-451表达下降(以上P<0.05)；与I/R组、I/R+Ad-GFP组相比,I/R+Ad-miR-451组心肌梗死及心肌缺血边缘区范围下降,心肌组织炎性浸润程度减轻,细胞凋亡率下降,血清CK、LDH含量下降,心肌组织SOD活性上升,MDA含量下降,心肌组织HMGB1mRNA和蛋白含量,Caspase-3活化片段蛋白含量下降,miR-451表达上升(以上P<0.05)；与I/R组、I/R+Ad-GFP组相比,I/R+Ad-asmiR-451组心肌梗死及缺血边缘区范围无明显上升,心肌组织炎性浸润程度明显加重,细胞凋亡率无明显下降,血清CK、LDH含量明显上升,心肌组织MDA含量上升,SOD活性下降(P<0.05),心肌组织HMGB1mRNA上升(P<0.05),蛋白含量无明显上升,Caspase-3活化片段蛋白含量上升,miR-451表达下降(P<0.05)。 结论： 1.在HEK293细胞中采用AdEasy腺病毒包装系统可成功构建上调及下调miR-451表达的重组腺病毒Ad-miR-451及Ad-asmiR-451,经过扩增、纯化获得的病毒液滴度约为3×1011pfu/ml。 2.细胞水平研究证实miR-451为调节HMGB1的靶miRNA,上调miR-451可在转录和转录后水平抑制缺氧再复氧时心肌细胞中HMGB1的表达,改善缺氧再复氧诱导的心肌细胞损伤,这种保护作用可能与改善氧化应激损伤和细胞凋亡相关。 3.动物水平研究证实miR-451可在转录水平和转录后水平调控大鼠缺血再灌注心肌中HMGB1的表达,上调miR-451可通过抑制HMGB1表达改善大鼠心肌缺血再灌注损伤,这种保护作用可能与改善炎症反应、氧化应激损伤和细胞凋亡相关。