PC12细胞中MPP+诱导的α-synuclein聚集和自噬对其降解机制研究

第一部分二巯基异构酶S-亚硝基化促进α-synuclein聚集 目的利用MPP+诱导PC12细胞建立帕金森病细胞模型,研究氧化应激和氮化应激反应在帕金森病发病中的作用,以及PDI过亚硝基化以及PDI与α-synuclein异常聚集的关系,从抑制α-synuclein聚集角度探讨帕金森病细胞保护策略。 方法以MPP+诱导PC12细胞,建立帕金森病细胞模型,利用一氧化氮合酶抑制剂及一氧化氮前体物质分别或者共同作用于帕金森病细胞模型,检测一氧化氮生成水平及PDI S-亚硝基化程度,PDI S-亚硝基化采用生物素标记方法检测,同时WB检测α-synuclein表达水平,研究分析在帕金森病中PDI S-亚硝基化与α-synuclein聚集的关系。 结果(1)MPP+处理的PC12细胞导致氧化应激和氮化应激反应,NO生成明显增加,细胞活性显著下降,α-synuclein表达增加;(2)WB方法检测MPP+处理后的PC12细胞总PDI表达量没有显著变化。但是PDI S-亚硝基化水平明显增加,表明MPP+导致了PC12细胞PDI S-亚硝基化反应,同时α-synuclein表达增加;(3)使用一氧化氮合酶抑制剂后NO生成减少,PDI S-亚硝基化水平降低,同时α-synuclein聚集减少,提示α-synuclein异常聚集和PDI S-亚硝基化水平有关;(4)一氧化氮前体物质L-精氨酸可以抵消一氧化氮合酶抑制剂的作用,导致一氧化氮合酶抑制剂阻止PDI S-亚硝基化作用消失。 结论PDI S-亚硝基化在帕金森病细胞模型对α-synuclein异常聚集具有促进作用,当PDI发生过亚硝基化时其抑制α-synuclein聚集作用消失,氮化应激、NO生成过多与PDI S-亚硝基化反应有关,抑制PDI S-亚硝基化反应可以阻止α-synuclein聚集,具有细胞保护作用。 第二部分联合调节mTOR和IP3促进α-synuclein自噬降解 目的研究锂剂在帕金森病细胞模型中对α-synuclein降解的作用,并探讨其可能机制。 方法根据不同浓度氯化锂对PC12细胞活性的影响选择合适的氯化锂作用浓度,利用PC12细胞经过MPP+处理制作帕金森病细胞模型,氯化锂单独处理以及氯化锂和雷帕霉素(Rapamycin,Rap)共同处理MPP+诱导PC12细胞帕金森病细胞模型,MTT法检测细胞活性,Elisa检测IP3的变化、West blot检测α-synuclein聚集的影响及自噬标志物LC3蛋白表达的变化,探讨氯化锂调节自噬的机制。 结果锂剂单独作用于MPP+处理过的PC12细胞对α-synuclein和自噬的影响不明显,但是当锂剂和雷帕霉素共同作用时,可以显著上调自噬,并减少α-synuclein的聚集,达到细胞保护作用,和雷帕霉素具有协同作用。 结论锂剂通过抑制mTOR上游物质糖原合成酶激酶-3β抑制自噬,通过减少IP3水平促进自噬,和mTOR抑制剂雷帕霉素联合应用可以充分发挥两者上调自噬效应,增强对异常聚集α-synuclein清除,保护细胞免受损害,雷帕霉素和氯化锂在上调自噬促进异常聚集α-synuclein具有协同作用,对帕金森病具有潜在治疗价值,值得进一步研究。 第三部分丁苯酞对MPP+处理的PC12细胞的保护作用及对α-synuclein聚集影响 目的研究丁苯酞在MPP+处理的PC12细胞中的抗氧化应激、氮化应激及线粒体保护作用及其对PDI S-亚硝基化和α-synuclein聚集的影响。 方法MTT法检测丁苯酞对MPP+处理的PC12细胞活性影响,流式细胞仪检测活性氧、线粒体膜电位、NO、GSH试剂盒分别检测NO及GSH水平;激光共聚焦检测线粒体自噬;Western Blot检测α-synuclein、PDI蛋白表达水平,生物素标记法检测PDI S-亚硝基化程度。 结果(1)丁苯酞对MPP+处理的PC12细胞活性具有保护作用,呈剂量依赖性,NBP浓度为10μM时已经达到最有效的细胞保护作用,增加剂量并不能提高其对MPP+处理的PC12细胞的保护作用;(2)流式细胞仪检测活性氧,MPP+处理后活性氧显著增加,丁苯酞有效降低MPP+导致的活性氧增高,及MPP+导致的GSH水平下降;(3)丁苯酞在MPP+处理的PC12细胞中阻止MPP+引起的线粒体损害,减少线粒体自噬。(4)丁苯酞降低MPP+导致的NO合成增加,降低MPP+导致的PDI S-亚硝基化程度。使用一氧化氮合酶抑制剂后NO生成减少,PDI S-亚硝基化程度降低,同时α-synuclein聚集减少,提示α-synuclein异常聚集和PDI S-亚硝基化有关;(5)丁苯酞在MPP+处理的PC12细胞降低α-synuclein聚集。 结论丁苯酞在PC12细胞帕金森病细胞模型中具有细胞保护作用,作用机制系多方面的,包括抗氧化应激、氮化应激,保护线粒体,抑制PDI S-硝基及减少α-synuclein聚集等,对帕金森病具有潜在治疗价值。