一、目的与意义
神经根型颈椎病（cervical spondylotic radiculopathy,CSR）临床常见高发,人群总患病率达11.59-24.18%。CSR是指由于颈椎退变、神经根受压迫等因素导致其支配区域出现一定程度的疼痛、麻木、感觉缺失和运动功能改变,其主要症状为根性神经痛（radicular neuralgia）。临床许多CSR患者通过中医药治疗可以获得满意的效果。中药川芎具有行气开郁、祛风燥湿、活血止痛的功效,是临床治疗神经根型颈椎病的主要药物,研究川芎具有重要的科学价值和社会经济效益。
川芎内多种活性成分如挥发油类（如藁本内酯）、酚酸类（如阿魏酸）、生物碱类（如川芎嗪）等,分别通过改善微循环、稳定细胞膜、抗自由基等多个环节起到神经保护作用。而某些针对川芎嗪的提取法会造成其它有效成分的损失,并且川芎中川芎嗪含量非常低,大约占川芎中的千万分之几,所以提取方法应兼顾所有传统应用川芎治疗疾病的主要活性成分。故我们在本药理实验中根据治疗目的选择了合适的提取方法。同时对药理学实验的提取物进行质量控制,选择含量较高、HPLC检测灵敏度高、其药理作用与实验目的直接相关的阿魏酸作为定量指标,采用质量标准控制药理学实验剂量的有效物质浓度,对川芎治疗作用的量效关系进行更精确的衡量。
观察川芎对神经根型颈椎病大鼠受损神经根是否具有形态保护作用,以及相关的促进神经电生理恢复、进而治疗减轻疼痛的作用,以这种量化研究为临床用药提供剂量参考。
二、供试药液的制备及质量控制
1.供试品溶液的制备方法川芎饮片加入8倍量水,不泡,冷凝回流水提4小时,收集挥发油备用过滤,减压浓缩加入挥发油混匀。
2.质量控制精密量取稀释定容于10ml容量瓶中,摇匀,取适量用微孔滤膜（0.45μm）滤过,取续滤液即得。依据05药典对川芎提取液进行化学成分薄层色谱法（TLC）定性分析（附录appendixVIB）;高效液相色谱仪（HPLC）测定阿魏酸（FA）含量作为定量指标。
三、模型的建立及干预
1.模型的建立及干预
所有大鼠在造模术前行左侧诱发电位检测,获取正常值。仿照文献[5]施椎管插线造模手术,略作改进:以0.8cm长直径0.55 mm尼龙渔线制备插线,C7椎板开窗后,分别沿脊髓纵轴插入至C4-C7、C6-T1颈脊神经肩上,部分重叠。
入组标准术中及术后死亡4只。余50只大鼠在术后第5天接受评价筛选符合条件:①造模前后术侧E'-C6Lat的增长为0.2-0.4ms;②步态评分为2-3分,无脊髓压迫症状。颈复康及模型组分别给1:1颗粒溶液1ml·kg-1·d-1及生理盐水,所有处理组给药均定容到3ml灌胃,给药时间为10天。
共42只大鼠符合要求。随机抽取40只大鼠进入实验,随机分为5个处理组:川芎药液高、中、低剂量组、模型组、颈复康组。药理实验高、中、低剂量组川芎提取物每日剂量中FA含量分别控制为:252.2、126.1、63.05mg·kg-1·d-1。
2.模型评价方法
行为学观察实验开始及结束时分别测量大鼠体重;每日在9:00-10:30间将大鼠放置在观察箱中30min后观察:有无自噬、舔咬、嘶叫等;接触记录5min内患肢离地的累积时间,取三次的平均值;结合Kawakami与Dubuisson法对其由疼痛挛缩造成的步态障碍进行评估:1分=正常步态、足无畸形;2分=受损伤足轻触玻璃台面,不持重或轻微持重,走时跛行;足内收蜷缩畸形;3分=受损足抬起,走动时不着台面;伴显著足内收蜷缩畸形。
神经电生理测量方法如文献,刺激和记录均使用2402号针灸针,参考电极置于附近1cm处皮下,余同文献。记录并计算术侧锁骨上窝（Erb's）点与C6椎板上点潜伏期的差值（Lat）、C6椎板上点波幅（Amp）,计算感觉电位传导速度（MCV）,每次测量重复两次取均值。
病理切片的制作与观察方法如文献,HE染色,光镜观察有无神经水肿及炎症细胞浸润等。在光镜下放大10×20倍观察,每一病例随机取3张切片,每张切片随机取5个视野,分别统计各组出现:神经细胞空泡样变、坏死灶、轴突扭曲髓鞘脱失呈鱼骨状等阳性病变的病例数。
统计处理计量资料以均数±标准差(（?）±s)表示,使用SPSS11.5行单因素方差分析,神经电生理与行为学测量数据的组间差异均使用LSD-t检验。
3结果
3.1 TLC鉴定结果川芎内化学成分符合要求,HPLC检测求得提取物浓度为46.4939mg·ml-1;三批验证试验RSD=1.88,故药液（1:1）中FA的平均浓度45.0365 mg·ml-1。
3.2川芎提取物对神经根型颈椎病大鼠根性疼痛行为的影响
所有大鼠无一脱失,均进入实验结果分析,无显著的体重减轻。伤口愈合良好,无脓性分泌物,无自噬及舔咬。实验结束时,模型组大鼠疼痛行为无显著改善,川芎提取物高、中、低剂量组治疗后自发痛分值显著降低（ANOVA,P=0.005）,治疗前后测量的自发痛差值与模型组相比差异有统计学意义降低（ANOVA,P＜0.000）;步态障碍分值显著降低降低（ANOVA,P=0.001）;治疗前后测量的步态障碍差值与模型组相比差异有统计学意义降低（ANOVA,P=0.015）。
3.3川芎提取物对神经根型颈椎病根性疼痛大鼠神经电生理的影响
模型组实验结束诱发电位潜伏期、波幅、传导速度无显著恢复或未恢复到正常水平.川芎提取物高、中、低剂量组治疗后因造模增长的潜伏期显著减短,与模型组相比差异有统计学意义（ANOVA,P＜0.000）,治疗前及治疗后两次所测潜伏期的差值与模型组相比差异有统计学意义（ANOVA,P＜0.000）;治疗后感觉电位传导速度显著恢复,与模型组相比差异有统计学意义（ANOVA,P＜0.000）,治疗前及治疗后两次所测感觉电位传导速度的差值与模型组相比差异有统计学意义（ANOVA,P＜0.000）;治疗后测量的波幅差值与模型组相比差异有统计学意义（ANOVA,P=0.002）,治疗前及治疗后两次所测波幅的差值与模型组相比差异有统计学意义降低（ANOVA,P＜0.000）。
3.4川芎提取物对神经根型颈椎病根性疼痛大鼠神经根病理形态的影响
模型组大鼠颈神经根组织病理切片形态学观察神经变性较严重,显著地水肿变性空泡变的例数为5,神经节细胞坏死灶的例数为4,轴突髓鞘脱失、扭曲呈鱼骨状变性的例数为4。川芎提取物治疗组神经损伤程度较轻,高剂量组出现上述严重变性的例数分别2、1、2;中剂量组出现上述严重变性的例数分别为3、2、3;低剂量组出现上述严重变性的例数分别3、3、3。
四、结论
1.对于采用传统水提合并挥发油采集法提供的川芎内有效物质,高效液相色谱仪测定阿魏酸含量是稳定灵敏的质量控制手段,不仅可以反映提取物中有效物质的含量,同时也和药物的疗效成正比,是合适的药理实验指标。
2.采用尼龙渔线对颈神经根及背根节的卡压法可以建立稳定的神经根型颈椎病根性痛的动物模型,正中神经短潜伏期诱发电位是神经根损伤及好转的情况的可靠检测手段。
3.川芎提取物在FA剂量为252.2、126.1、63.05mg·kg-1·d-1时对椎管插线法建立的神经根型颈椎病根性痛大鼠具有明显的减轻疼痛的作用,保护了神经形态,促进了感觉诱发电位检测结果的恢复。且有一定的量效关系。以高剂量组效果为优,提示川芎提取物在FA浓度为252.2、126.1、63.05mg·kg-1·d-1时灌胃可以减轻神经根型颈椎病根性痛,与其神经保护作用有关。
