柚皮苷对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和骨向分化的影响

目的：研究骨碎补的有效成分柚皮苷对体外培养的BMSCs增殖和骨向分化的影响，确定诱导的最佳添加浓度和添加时间，以及在诱导过程与向OB分化相关的重要蛋白BMP-2和Cbfa1mRNA的影响，从不同角度探讨中药防治骨质疏松的机理。 方法： 1．运用全骨髓贴壁法分离、培养病鉴定SD大鼠的BMSCs； 2．将柚皮苷配成高中低三大组浓度，每大组中再设置不同的浓度梯度，用CFU-F和MTT法检测柚皮苷对BMSCs增殖的影响，了解量效关系(CFU-F：2μg/ml～500μg/ml；MTT：0.06μg／ml～500μg／ml)，并分别设置对照组； 3．用改良钙钴法对加入柚皮苷诱导后的细胞进行ALP染色，确定柚皮苷是否具有成骨诱导作用，并通过ALP阳性细胞计数，确定柚皮苷的添加浓度(2μg/ml～500μg/ml)和添加时间(3～15d)，空白组为对照组； 4．用最佳浓度的柚皮苷诱导BMSCs向OB分化，分柚皮苷组、空白组、经典诱导组、柚皮苷和经典诱导液协同作用组共四组，检测ALP和BGP的分泌情况，并观察经典诱导液与柚皮苷的交互作用； 5．运用RT-PCR的方法检测各诱导体系诱导分化过程中与OB分化相关的信号蛋白BMP-2和Cbfa1mRNA的影响，分组同上。 结果： 1．BMSCs分离后24h基本贴壁，12-15d达到融合，经过成骨、成脂和成软骨诱导培养，BMSCs分别表现出成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞表型； 2．不同浓度的柚皮苷作用后，MTT显示：低浓度柚皮苷组的OD值高于空白组，并存在一定的量效关系，与空白组相比有显著差异(P＜0.05)，且以1.0μg/ml和1.5μg/ml效果最好，中浓度柚皮苷组与空白组相比无明显差异(P＞0.05)，高浓度柚皮苷组的OD值远低于空白组(P＜0.05)，CFU-F显示的集落数结果和MTT类似； 3．ALP阳性细胞计数示，柚皮苷具有确定的诱导BMSCs向OB分化，其低中浓度对诱导分化的影响无显著差异(P＞0.05)，考虑成本选用2μg/ml为最佳浓