青藤碱联合甲氨蝶呤抑制类风湿关节炎骨破坏的作用及机制研究

目的 探讨青藤碱(Sinomenine, SIN)联合甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)抑制类风湿关节炎骨破坏的作用及机制。 方法 实验一 建立Ⅱ型胶原蛋白诱导的SD大鼠关节炎模型,随机分为模型组(生理盐水灌胃)、青藤碱组(正清风痛宁120mg/kg.d,灌胃)、MTX组(1mg/kg.w,腹腔注射)、联合组(正清风痛宁+MTX组,正清风痛宁120mg/kg.d和MTX1mg/kg.w),另设7只作为正常对照组。首次免疫注射第21天开始给药。采用关节评分法评估关节炎症程度；并用ELISA法分析大鼠血清中OPG、RANKL、IL-17、IL-1α、IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-13的表达水平；大鼠关节HE染色的组织病理变化及免疫组化比较RANKL、OPN表达的变化。 实验二 从RA患者滑膜组织分离培养FLS,用不同质量浓度的SIN(1,0.1,0.01,0.001mg/ml)与MTX(1,0.1,0.01,0.001mg/ml)单独或联合干预。用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞增殖情况；用流式细胞术检测细胞凋亡情况；用半定量RT-PCR的方法检测FLS中NF-κB受体活化因子配体(RANKL)、骨保护素(OPG)的mRNA表达水平。 实验三 从健康人外周血中分离PBMC,用不同质量浓度的S1N(1000,100,10uM)与MTX(10uM)单独或联合干预,用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞增殖情况；用RANKL (60ng/ml)、M-CSF (20ng/ml)诱导PBMC分化成破骨细胞(OC),加入不同质量浓度的SIN与MTX单独或联合干预,第15d终止培养,ELISA法测定各加药组细胞上清液中分泌的MMP-9水平；同时细胞固定行TRAP染色,观察药物干预对于OC分化的影响；用定量RT-PCR的方法检测PBMC中破骨细胞分化转录因子NFATc1mRNA的表达水平。 结果 实验一 1.造模后,大鼠关节炎肿胀程度在第21d最为明显,然后逐渐消退,在第35d左右会出现第2个炎症高峰。SIN组、MTX组和联合组均可减轻关节肿胀,与造模组比较,关节炎指数评分在第46d均有明显下降(P<0.05)。 2.与模型组比较,MTX组、联合组可明显抑制大鼠血清IL-1α的表达水平(P<0.05),IL-6表达水平也有下降,但差异无统计学意义(P0.05)；与MTX组比较,联合组IL-1α、IL-17水平显著降低(P<0.05)。 3.与模型组比较,SIN组、联合组都可明显抑制血清MMP-3和MMP-13的产生,MTX组MMP-13水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)；与MTX组相比,联合组血清MMP-3的表达水平下降(P<0.05)。 4.与模型组比较,SIN组、MTX组和联合组外周血OPG水平均明显升高,MTX组可降低血清RANKL的表达水平,三组OPG/RANKL的比值显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)；与MTX组相比,联合组OPG/RANKL比值升高(P<0.05)。 5.与正常组比较,模型组炎性组织侵润关节腔隙,使得腔隙变窄。SIN组、MTX组和联合组均能改善炎性细胞的侵润,联合组能更有效抑制CIA大鼠滑膜关节炎症与组织破坏。 6.与正常组比较,模型组滑膜组织OPN、RANKL蛋白表达显著增高(P<0.05)；与模型组比较,联合组、MTX组、SIN组均能降低OPN、RANKL蛋白的表达(P<0.05)；与MTX组相比,联合组OPN、RANKL蛋白的表达明显下降(P<0.05)。 实验二 1.各不同质量浓度药物组对RA FLS的增殖均有显著的抑制作用(P<0.05)；但在0.001mg/ml至1mg/ml的浓度范围内,同种药物干预组(SIN单用、MTX单用、SIN与MTX联合)的抑制作用与药物浓度并无明显正相关性；SIN0.1mg/ml+MTX0.1mg/ml组较其他非联合用药组对RAFLS的抑制作用显著增强(P<0.05)。 2.流式细胞仪检测各组凋亡细胞百分率结果显示：空白对照组25.3%,MTX组(MTX0.1mg/ml)28.4%,SIN组(SIN0.1mg/ml)32.3%,联合组(MTX0.1mg/ml+SIN0.1mg/ml)34.7%。各加药组凋亡细胞百分率均高于空白对照组,但SIN组和联合组明显诱导RAFLS凋亡(P<0.05)；与MTX组比较,联合组凋亡细胞百分率有明显增多(P<0.05)。 3.RT-PCR结果显示：与空白组比较,MTX组(MTX0.1mg/ml)、SIN组(SIN0.1mg/ml)、联合组(MTX0.1mg/ml+SIN0.1mg/ml) RANKL电泳条带均弱；联合组OPG电泳条带较空白组强。联合组能够有效下调RA FLS的RANKL mRNA表达,并上调其OPG mRNA表达(P<0.05)。 实验三 1.加药组对PBMC增殖的影响,MTT结果显示各浓度组药物(包括联合给药),在不同药物组处理细胞48h后,并未影响细胞的增殖(P>0.05)。 2.加药组对OC的分化均有不同程度的抑制作用,ELISA结果显示,高浓度SIN与MTX(SIN1000uM+MTX10uM)合用时,能够明显抑制MMP-9的分泌,其他给药组分泌的MMP-9未显示出差异；该浓度的药物处理诱导分化的PBMC, TRAP染色后显微镜下观察分化成熟的OC数目,结果显示联合组(SIN1000uM+MTX10uM)与对照组和单独用药组比较OC数目显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。 3.RT-PCR结果显示：与对照组及MTX组比较,给药24h后,SIN联合MTX(SIN1000uM+MTX10uM)能够有效下调PBMC中的NFATcl mRNA表达(P<0.05)。 结论 实验一 SIN与MTX联合给药对CIA大鼠关节肿胀有明显的防治效应,能够较好地控制炎症发生发展,可能与其对血清IL-1、IL-6、IL-17等抑制作用有关；协同提高外周血OPG、OPG/RANKL比值、抑制MMP-3和MMP-13的产生；抑制关节血管翳的形成和炎性因子的侵润,下调滑膜组织RANKL及OPN的表达水平。提示SIN联合MTX对类风湿关节炎的软骨和骨有协同骨保护作用。 实验二 本实验表明SIN与MTX联用对RAFLS具有协同抑制效应,并可能由此实现对RAFLS介导的骨破坏的治疗作用。 实验三 本实验表明SIN与MTX联用通过抑制外周血中单核细胞NFATc1基因的表达,减少MMP-9分泌,从而抑制OC的分化,而且该抑制作用有药物浓度依赖关系。