一、目的
通过考察甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对Caco-2细胞膜上P-gp功能和表达的影响,筛选其有效成分以备进一步探讨甘草新的解毒机制。
二、方法
1细胞培养及形态学验证
为甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对P-糖蛋白(P-gp)功能和表达的作用研究提供P-gp载体细胞和阴性对照细胞。
人结肠癌细胞(Caco-2)和脐静脉内皮细胞(ECV304)分别采用MEM培养基、1640培养基进行常规培养；细胞免疫荧光法进行细胞膜上P-gp表达验证。
2细胞毒性试验
用MTT法分别考察甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)、利福平与维拉帕米对Caco-2细胞及ECV304细胞的毒性,选择细胞存活率大于90%的药物浓度作为无毒浓度进行下一步细胞实验。
3甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对P-糖蛋白功能的影响
用流式细胞仪测定细胞内罗丹明123的荧光强度,考察甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对P-糖蛋白介导的罗丹明123外排作用的影响,从而判断药物对P-糖蛋白的功能有何影响。
4甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对P-糖蛋白表达的影响
将甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)与细胞作用72小时后,采用流式细胞术分析甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对Caco-2细胞膜上P-糖蛋白表达的影响。
三、结果
1细胞培养
Caco-2细胞和ECV304细胞在正常条件下生长旺盛,Caco-2细胞高表达P-糖蛋白,适合研究甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对P-糖蛋白功能和表达的影响；而阴性对照细胞ECV304细胞低表达P-糖蛋白,适合作阴性对照。
2细胞毒性实验
MTT结果显示甘草提取物、甘草酸、甘草苷、利福平和维拉帕米的浓度为0.01～100μg·mL-1,甘草次酸的浓度为0.01～10μg·mL-1时与Caco-2和ECV细胞培养72h后细胞的存活率>90%,为非细胞毒性浓度,故选取甘草提取物、甘草酸和甘草苷的低、中、高浓度为1、10、100μg·mL-1,甘草次酸的低、中、高浓度为0.1、1、10μg·mL-1,阳性对照药品利福平和维拉帕米的浓度为10μg·mL-1进行下一步的研究。
3甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对P-糖蛋白功能的影响
100～1μg·mL-1的甘草提取物、甘草酸和甘草苷对P-糖蛋白介导的罗丹明123外排有显著的增强作用(P<0.05)。甘草提取物、甘草酸和甘草苷三种物质的低、中、高浓度组Caco-2细胞内Rho-123的荧光强度较阴性对照组显著降低了34.66%、28.90%、24.56%、27.89%、26.29%、37.33%、19.51%、21.86%和19.03%。
4甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)对P-糖蛋白表达的影响
甘草提取物中浓度组,甘草甜素低、中、高浓度组,甘草次酸中、高浓度组Caco-2细胞膜上P-gp的阳性率较阴性组分别显著增加了31.18%、61.67%、70.32%、77.43%、37.58%和49.14%(P<0.05),显示甘草提取物、甘草甜素和甘草次酸在一定浓度范围内能够显著上调P-gp的表达水平,甘草酸和甘草次酸的作用在该浓度范围呈浓度依赖性。甘草苷在较低浓度时能显著抑制P-gp的表达,甘草苷低浓度组P-gp的阳性率相比阴性组显著降低37.17%(P<0.05)。
四、结论
甘草提取物及其三种主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)能够影响Caco-2细胞膜上P-gp的功能和表达。甘草酸单胺盐的瞬时作用(60min)能浓度依耐性的诱导P-糖蛋白的功能,长时作用(72h)能浓度依耐性的上调P-糖蛋白的表达水平,可能是甘草诱导P-gp功能和表达的主要成分。通过诱导P-gp功能和上调其表达,从而促进P-gp介导的胞内毒物外排,这可能为甘草解毒机制的研究提供了重要的理论基础。
