α-硫辛酸抗大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制的研究

背景： 近年来心血管系统疾病特别是冠心病的发病率逐年攀升，严重的危害了人类健康。一旦出现冠状动脉阻塞，其首要的治疗措施即为及时恢复其血供，改善心肌血液灌注。但心肌缺血再次恢复血液供应后常常会出现缺血再灌注（I/R）损伤，即恢复血供后出现心肌梗死面积增大、发生心室颤动等恶性心律失常、心脏收缩功能降低等心肌受损现象。目前认为心肌的缺血再灌注损伤多与再灌注后氧自由基的增加、心肌细胞的凋亡、钙离子超载、炎性介质浸润等因素相关。α-硫辛酸（LA）是一种在蔬菜及肉类中发现的万能抗氧化剂，是同时具有脂溶性及水溶性的抗氧化剂，可清除体内自由基、螯合金属离子等。目前已有相关研究表明LA在治疗氧化应激相关疾病方面有明显的作用，而针对LA对心肌缺血再灌注损伤后心肌的保护作用方面的研究也在进展中，但其具体保护效果及作用机制仍不清楚。因此，通过构建大鼠心肌缺血再灌注损伤研究LA对灌注后心肌的保护作用及其作用机制对于充分认识LA有深远的意义。 目的： （1）明确LA是否在大鼠心肌I/R损伤中起到了保护性作用； （2）明确LA在大鼠心肌I/R损伤后是否通过抗氧化、抗炎等途径减少心肌损伤； （3）明确PI3K/Akt/Nrf2信号通路是否在LA对抗心肌I/R损伤中起到信号转导的作用。 方法： （1）选取成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组（sham I/R）、I/R损伤+盐水对照组（I/R+V）、I/R损伤+LA组（I/R+LA）、I/R损伤+LA+wortmannin组（I/R+LA+W）。LA给药量为15mg/kg，在进行心肌缺血手术前30分钟通过大鼠尾静脉给药。Wortmannin为PI3K通路阻滞剂给药量为15ug/kg，在给予LA前5分钟通过大鼠尾静脉给药。大鼠麻醉后切断左侧第4肋骨，暴露心脏，选择性结扎冠状动脉左前降支，进行缺血30分钟，打开结扎线进行再灌注，进行各项检测。 （2）再灌注后3小时后提取血清进行乳酸脱氢酶（LDH）及肌酸激酶（CK）的活性检测；提取心肌左室缺血组织，通过末端脱氧核苷基转移酶介导的dUTP原位末端标记法（TUNEL）及DAPI细胞核染色测定心肌细胞凋亡指数（AI）及Caspase-3凋亡蛋白的活性。检测心肌组织及血浆中血清髓过氧化物酶（MPO）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的活性。 （3）灌注24小时后取心肌组织标本通过伊文氏蓝-TTC染色法测定心肌梗死面积。 （4）灌注72小时后通过M型超声测定大鼠左室收缩末、舒张末容积及左室射血分数。 （5）通过免疫印迹技术检测心肌组织中Akt、iNOS含量及磷酸化水平，测定HO-1、Nrf2、p38-MAPK、NOx等蛋白成分的水平。 结果： （1）与对照组相比，LA减少再灌注3小时后血清中CK及LDH含量，两组之间有非常显著差异（P<0.01）；给予PI3K通路阻滞剂Wortmannin后，CK及LDH较LA组均升高，差异有显著性（P<0.05）。其次，与对照组相比，LA组心肌梗死区大小（P<0.01）、凋亡指数（P<0.01）、Caspase-3活性均明显降低（P<0.05）；LA组大鼠心脏收缩功能上比生理盐水组明显升高，其左室射血分数高于其他各组（P<0.05），提示LA对I/R损伤后的心肌组织起到了明显的保护作用。而PI3K通路阻滞剂Wortmannin组的保护效果均被所阻断。 （2） LA组大鼠I/R损伤后局部及全身炎症反应明显减轻，MPO及血清、心肌组此作用被明显抑制。 （3） LA组大鼠心肌组织中p38-MAPK、NOx、iNOS等的水平与盐水组相比无明显差异，提示其可能未介导LA的心肌保护作用。 （4） LA组大鼠心肌组织磷酸化程度增加，Akt、核Nrf2及HO-1含量均增加（P<0.05），且此作用可被PI3K通路阻滞剂Wortmannin所阻断，提示PI3K/Akt/Nrf2通路在心肌I/R损伤后的心肌保护中起到了重要作用。 结论： （1） LA可明显减轻大鼠I/R损伤后的心肌细胞及全身炎症反应，有效减轻再灌注后的氧化应激，提高了大鼠心肌对抗I/R损伤的能力。 （2）研究证实LA可明显减轻大鼠I/R损伤后心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡，改善心肌收缩功能，明显减轻了心肌细胞缺血再灌注后的损伤。 （3）本研究首次发现LA增加了心肌细胞中Akt、核Nrf2及HO-1的表达，且其作用可被PI3K通路阻滞剂Wortmannin所阻断，说明PI3K/Akt/Nrf2通路在LA对I/R损伤后心肌的保护作用中起到了重要作用。