淫羊藿苷及其拟代谢产物的雌激素样作用体外研究

淫羊藿（Herba Epimedii）为传统补益中药，常用于治疗男女性功能障碍、骨质疏松、更年期综合征、高血压、冠心病等疾病。淫羊藿提取物具有典型的植物雌激素样作用，因此推测其上述主治功效与药材中某种（或某些）具有雌激素样作用的成分有关。淫羊藿苷（Icariin,ICA）被认为是淫羊藿属植物的特征成分，《中国药典》规定其含量作为淫羊藿药材及其制剂的质控标准。体内代谢研究发现，芒柄花黄素（Formononetin）代谢成大豆黄素（Daidzein），鹰嘴豆素A（Biochanin A）代谢成金雀异黄素（Genistein）后雌激素样活性大大增强，推测ICA可能存在与此相同的体内代谢行为。本研究采用现代细胞分子生物学实验方法研究ICA及其拟代谢物淫羊藿素（Icaritin,ICT）和去甲淫羊藿素（Desmethyliearitin,DICT）的雌激素样作用及其构效关系，为阐明中药淫羊藿主治功效的物质基础提供科学依据。 1．ICT和DICT的制备及质谱分析 ICA在纤维素酶催化下水解葡萄糖和鼠李糖，乙酸乙酯萃取得到ICT。质谱结果显示分子离子峰m/z为368，比ICA分子量少308，失去的原子量刚好是一分子葡萄糖和一分子鼠李糖之和，与ICT分子量完全一致。 ICT在BBr3和CH2Cl2的体系中脱去4′甲基，乙酸乙酯萃取反应产物，制备型高效液相纯化得到DICT。质谱结果显示分子离子峰m/z为354，比ICT分子量少14，失去的原子量刚好相当于一个甲基，与DICT分子量完全一致。 2．ICA、ICT、DICT对细胞增殖率的影响 用人乳腺癌MCF-7细胞和T47D细胞体外增殖实验（E-SCREEN法）评价受 浙江大学硕士学位论文 淫羊箱普及其拟代谢产物的雌激素样作用体外研究 试物的雌激素样作用。MCF一7细胞和T47D细胞以适当密度接种24孔板，常规 培养ld后换成实验培养液（无内源性雌激素），预培养1Zd后，换液并加受试 物和阳性药雌二醇（Estradiol，几），分别继续培养6d、9d，M竹法检测细胞增 殖率。 实验结果显示IcT和DlcT都能显著诱导McF一7细胞增殖，10一mol几达到 最大，分别是溶剂组的4.巧、4.34倍（P<0.01，E:为4.61倍），IcA未呈现促 MCF一7细胞增殖作用（P>0.05）。ICT和DICT也均能显著诱导T47D细胞增殖， 一。一mo比达到最大，分别是溶剂组的1.75、1.36倍护<0.01，E2为2.65倍)，nICT 促增殖作用较ICT弱，两者有显著性差异（P<0.05）。提示ICT和DICT有雌激素 样作用，而ICA则未体现该作用;DICT促增殖作用较ICT弱，可能与DICT对 T47D细胞中ERp比ICT具有更高的选择性有关。 3.ICI 182，780（ICI）对MCF-7细胞和T4，细胞增殖的拮抗作用 为验证受试物促MCF一7细胞和T47D细胞的增殖作用是否通过雌激素受体 （Estrogen Reeeptors，ERs）介导，E:组和ICA、ICT、DICT各浓度组同时加入 终浓度为10’7mo比雌激素受体完全拮抗剂ICI，培养及检测方法同上。实验结 果显示EZ、ICT和DICT诱导MCF一7细胞和T47n细胞增值作用被10一mo比Iel 完全拮抗，几+ICI、ICA+ICI、ICT+ICI和DICT+ICI组与溶剂对照组的细胞 增殖情况无显著性差异（办0.05）。提示ICT和DICT通过ERs介导发挥促McF一7 细胞和T47D细胞增殖作用。 4.ICA、ICT、DICT对T47D细胞周期的影响 T47D细胞常规培养ld，换实验培养液预培养2d，换液并加10石m。比ICA、 ICT和DICT，继续培养3d，收获细胞，固定、碘化丙咤DNA染色，上流式细 胞仪检测。结果显示ICT和DICT均能改变T47D细胞周期，使Gl期细胞减少， S期细胞增加，提高细胞增殖指数(P roliferating index，pl=（s+GZM） /（Gl+S+qM）x 100%)，Pl分别是溶剂对照的1.45、1.41倍（E2为1.74倍），此作 用能被ICI完全拮抗。提示ICT和DICT确实具有促T47D细胞增殖的雌激素样 作用。 浙江大学硕士学位论文 淫羊若昔及其拟代谢产物的雌激素样作用体外研究 5.PR、ERa、E邓基因mRNA表达的变化 MCF一7细胞和T47D细胞培养方法同上，用Trizol试剂提取细胞总RNA， M一MuLV酶逆转录得到cDNA，上述cDNA加入PCR反应体系中用几q DNA聚合 酶扩增目标片段，1 .5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果，以p一actin为内 参照，定量分析PR、ERa、ERp的mRNA的表达。 实验结果显示，ICT和DICT能明显诱导MCF一7细胞和T47b细胞中PR基 因mRNA的表达，ICT组分别是溶剂组的6.19和2.33倍，DICT组分别是溶剂 组的3.69和2.1倍（EZ分别为11.77和3.87倍），此作用被ICI完全拮抗。ICA 未体现诱导MCF一7细胞PR基因的mRNA表达作用，对T47D细胞稍有诱导作 用，为溶剂组的1.34倍。进一步从基因转录水平确认了ICT和DICT具有显著 的雌激素样作用。 ICT和DICT对MCF一7细胞和T47D细胞ERa基因mRNA表达影响都相对较小， ICI对MCF一7细胞ERa基因mRNA表达有一定的抑制作用，最低表达只有溶剂组的 55%（ICA+ICI）:ICI对T47D细胞ERa基因mRNA影响相对较小，最低表达量为 溶剂组的81%（ICT+ICI组）。MCF一7细胞ERp基因mRNA目标片段呈阴性。而ICT 和DICT均明显增加T47D细胞ERp mRNA的表达，分别为溶剂组的1 .79、2.27倍（EZ 为3.51倍），ICI可抑制这种诱导作用。提示MCF一7细胞ERp在mRNA水平不表达， DICT对T47D细胞ERp mRNA诱导作用较ICT强。 6.MCF一7细胞和T47D细胞E助和ERp蛋白的表达