银杏外种皮多糖的分离纯化及活性研究

银杏是世界上珍贵的药用植物之一，其叶、果和外种皮等皆具有药用开发价值，被称为“全身都是宝的活化石”。据统计，目前我国银杏种植已遍及全国27个省(市)，年产银杏白果1.2万吨以上，而外种皮部分约占整个银杏果实的70％，据此估计我国每年至少有3万吨以上新鲜银杏外种皮，若除去其中60％的水分，干银杏外种皮每年超过1.2万吨。由银杏叶开发而成的银杏提取物(EGb)及其制剂是目前深受人们欢迎的天然药物之一，由白果开发而成的各种营养食品也很多，唯有银杏外种皮开发利用率低。 多糖是一重要的生物活性成分。研究报道银杏外种皮水提多糖具有抗肿瘤、免疫调节和抗衰老等多种活性，因此，研究开发农业废弃物银杏外种皮，则能变废为宝，综合利用银杏资源。本论文以银杏外种皮为原料，研究了银杏外种皮多糖的提取工艺及含量测定方法、银杏外种皮多糖的纯化技术、粗多糖和脱蛋白多糖的免疫活性和纯多糖及其乙酰化产物的抗肿瘤活性，主要研究内容和结果如下： 1．研究了水提法提取银杏外种皮多糖的工艺条件。以银杏外种皮多糖的提取率为考察指标，在单因素试验的基础上，采用三因素三水平正交实验法优选了提取工艺，得最佳提取工艺条件为：温度100℃、料液比1：12、时间1h和提取次数3次，在该工艺条件下多糖的提取率达95.09％；三因素对银杏外种皮多糖提取率的影响次序为浸提温度＞时间＞料液比。 2．研究了苯酚-硫酸法测定银杏外种皮多糖含量的方法。在单因素实验的基础上，采用三因素三水平正交实验优选了测定条件，得到最佳测定条件为：5％的苯酚溶液1.2 mL、硫酸用量4mL、显色温度30℃和显色时间20min，硫酸用量是影响显色的重要因素。该方法的加样回收率为99.60％，RSD=3.02％(n=5)。 3．研究了银杏外种皮粗多糖(GBEP-1)和脱蛋白多糖(GBEP-2)的免疫活性。结果表明GBEP-1小剂量组、GBEP-2小剂量组的吞噬百分数、吞噬指数与模型组均没有显著性差异，而GBEP-1大剂量组、GBEP-2大剂量组的吞噬百分数、吞噬指数与模型组有显著差异(p＜0.05或p＜0.01)。GBEP-1、GBEP-2给药组的吞噬百分数、吞噬指数都有进一步增强的趋势，并具有一定的量效关系；GBEP-1、GBEP-2小剂量组的溶血素水平与模型组没有显著的差异，而GBEP-1、GBEP-2大剂量组的溶血素水平与模型组有较大显著差异(p＜0.001)。随着剂量的增加，GBEP-1、GBEP-2给药组的血清溶血素抗体水平都有进一步增大的趋势，并具有一定的量效关系；GBEP-1小剂量组、GBEP-1大剂量组和GBEP-2小剂量组对于胸腺指数与模型组无显著差异，GBEP-1大剂量组、GBEP-1大剂量组、GBEP-2小剂量组、GBEP-2大剂量组胸腺系数、脾脏系数与模型组均有显著差异(p＜0.05或p＜0.01)。 4．使用DEAE-52纤维素和葡聚糖凝胶G-100层析柱，对银杏外种皮多糖进行纯化，得到了四个多糖组分GBEPP11，GBEPP22，GBEPP33和GBEPP44，纯度分别为90.87％、95.36％、92.57％和94.63％；同时采用高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱法(GS)法测定了分子量和单糖组成，得到四个组分的分子量分别为950604、311288、47987和3373，四个组分的单糖组成分别是：GBEPP11由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比为16：10：0.96；GBEPP22由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比为2.64：1：1.43；GBEPP33由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比为37.01：1：8.46；GBEPP44由鼠李糖和葡萄糖组成，其摩尔比为1.9：1。 5．采用MTT法，研究了银杏外种皮粗多糖，脱蛋白多糖和纯多糖各组分及GBEPP11乙酰化产物对人胃癌细胞株(AGS)，人胃癌细胞株(SGC)，人血癌细胞株(U937)的体外抑瘤作用，结果表明他们对这三种肿瘤细胞都有不同程度的抑制。其中GBEPP11的乙酰化产物的抑瘤活性好于其他样品。