水肿病、水肿病康复仔猪源乳酸菌的分离鉴定及其抑菌机理的研究

为了开发适用于猪的益生素,进一步明晰乳酸菌对仔猪特定肠道致病菌的作用机制,本研究从水肿病、水肿病康复仔猪小肠黏膜上分离鉴定出11株乳酸菌,并对其生长曲线、产酸、抑茵、胃肠道因素耐受等特性进行了研究,最后筛选出1株生长速度快,其它性能也较好的乳酸菌。整个实验分为四部分: 第一部分:试验选取泰州市饲养户同窝水肿病发病仔猪（6周龄）进行饲养,于水肿病发病仔猪病死后屠宰2头病死猪,并同时屠宰2头同窝水肿病康复仔猪。从水肿病病死猪肠系膜淋巴结分离并鉴定得到一株致断奶仔猪水肿病大肠杆菌O138;从水肿病、水肿病康复仔猪十二指肠、空肠肠黏膜分离到11株乳酸茵,均为革兰氏阳性。11株菌中有4株菌生长速度、产酸明显快于其它菌株（p＜0.05）,编号为L1、L2、L3、L4。将这4株乳酸菌分别进行菌种鉴定,得出L1为小鼠乳杆菌;L2为耐酸乳杆菌;L3为类似肠乳杆菌;L4基本与鼠李糖乳杆菌相同。 第二部分:研究了模拟胃肠环境因素即低pH值、胆盐、胃蛋白酶对乳杆菌L1、L2、L3、L4存活能力的影响,以及这4株乳酸菌的耐热特性。结果表明,L2、L3菌株对低pH值的耐受性较好,在pH值为2.0时,能够存活3 h,而L1和L4两菌株对低pH值的耐受性较差,在pH值为2.0时,仅能够存活0.5 h;随着pH值的升高,L1、L2、L3和L4 4菌株的存活率亦提高。以不含胆盐处理组为对照,胆盐浓度为0.08%时,L1、L2存活数由10～9降为10～8,L3的存活数由1010降为10～9,L4的存活数由10～8降为10～7;胆盐浓度为0.4%时,L1、L2存活数由10～9降为10～8,L3的存活数由1010降为10～8,L4的存活数由10～8降为10～7。在1%蛋白酶浓度下,L1、L2、L3和L4 4菌株的生长繁殖未受任何影响。以37℃处理20min为对照,50℃热处理对L1、L2、L3和L4 4菌株的存活无影响,65℃以上能显著影响L1、L2、L3和L4 4菌株存活数,80℃处理后L4已检测不到活菌,但L1、L3在80℃处理后仍有10～4的存活数。 第三部分:用体外厌氧发酵技术对实验一中从水肿病、水肿病康复仔猪十二指肠、空肠肠黏膜分离到的4株乳酸菌的产酸能力进行比较,并对其抑菌特性及其产生的抑菌物质的部分理化特性进行研究。结果表明:L3菌株产乳酸的速度最快,终末发酵液中乳酸含量最高,为60.48 mmol·L-1,pH值下降速度最快,终末pH值达到最低,为3.70。在抑菌实验中,L3对致断奶仔猪水肿病大肠杆菌O138,肠致病性猪大肠杆菌（K88、K99、987p）的抑制作用显著高于其它菌株（P＜0.05）;在低pH值条件下4株菌抑菌效果显著;排除酸后的结果表明,抑菌作用仍然保持90%以上,说明L3菌株的抑菌作用主要来自于产生的乳酸;抑菌物质具有热稳定性,经热处理后仍保有95%以上的抑菌效果;抑菌物质对蛋白酶不敏感,蛋白酶处理后仍保持90%以上的抑菌效果。 第四部分:研究了一株分离自断奶仔猪小肠黏膜的肠乳杆菌L3体外发酵特性,及其代谢产物对病原性大肠杆菌K88,O138存活的影响。体外发酵结果表明:12小时,L3菌液pH值迅速降至3.90,并产生大量乳酸,为104.08 mmol/L。L3菌株代谢产物对K88,O138体外生长抑制的动力学研究表明:L3菌株代谢产物对K88,O138存活具有很强的抑制作用;L3菌株发酵液与含相同浓度乳酸的自制培养液比较结果表明:乳酸在L3菌株代谢物对K88,O138存活抑制中发挥了主要作用;K88,O138对pH4.5的MRS培养液具有一定的耐受能力。