苦皮藤内生真菌农用活性成分的研究

本论文以一株编号为 2B 的苦皮藤内生真菌为出发菌株，应用形态学的方法鉴定了 其种属地位；研究了其代谢产物的农用生物活性，并对目标活性物质进行分离和结构解 析，采取诱变育种手段选育了高产菌株，并对高产菌株的发酵条件进行了优化。通过试 验结果的分析和讨论，取得了以下结论： 1 根据真菌的分类及鉴定方法，用光学显微镜观察 2B 菌株气生菌丝、大型分生孢 子、小型分生孢子及菌落性状，对比相关分类系统，将 2B 菌株鉴定为层出镰刀菌 (Fusarium proliferatum)。 2 在对 2B 菌株发酵产物生物活性研究中，发现 2B 菌株发酵产物甲醇提取物有明 显的抑菌活性，在 1000 μg·mL-1浓度下对番茄早疫病菌（Alternaria solani）、烟草赤星 病菌（Alternaria alternata）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、玉米大斑病菌 （Exserohilum turcicum）4 种供试菌的菌丝生长和孢子萌发抑制率均大于 80%；在盆栽 试验中，对黄瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）的治疗和保护作用均在 70%以 上。 3 采用常压柱层析、HPLC 制备等方法，在生物活性追踪指引下，从 2B 菌株发酵 产物分离出 4 个化合物 2B-1，2B-2，2B-3，2B-4。经波谱技术( IR，1H NMR，13C NMR， COSY，MS)，结合化学检验方法，并与相关文献对比，将分离得到的化合物分别鉴定 为 enniatin B，enniatin B1，enniatinA1，ergosterin。化合物 2B-1，2B-2，2B-3 在 100μg·mL-1 浓度下，对玉米大斑病原菌菌丝生长抑制率分别为 68.18%，87.49%，90.91%。 4 建立了恩镰孢菌素（enniatins）的 HPLC 检测方法。检测条件为色谱柱 (C18 柱， 0.9×30cm,10μm)；流动相(V∶V)甲醇∶水(88∶12)；流速 1 mL·min-1；检测波长 UV229nm；室温下 5μL 进样，该方法相对标准偏差 RSD< 1%，平均回收率在 98%以上。 5 采用紫外线（UV）,甲基磺酸乙酯（EMS），超声波+UV + EMS 3 种诱变方式进 行复合诱变，同时结合形态变异与产量之间的相关关系，挑选形态差异明显的单菌落， 然后通过摇瓶发酵筛选 enniatins 高产菌株，通过 3 轮诱变筛选大幅度提高了菌种的生 产能力，最后得到的突变株 UE152 代谢 enniatinns 总产量为 59.72 mg·100mL-1，是出发 菌株摇瓶效价 2.9 倍，且该突变株的高产遗传特性稳定。 6 通过单因子试验和多因子正交试验筛选获得 UE152 菌株最佳的摇瓶培养基配方 和发酵条件为葡萄糖 2%、土豆 20%、蛋白胨 0.5%、NH4Cl 0.3%、MgS040.1%和 CaCO3 0.1%，培养温度 26℃，接种量 10 块菌饼（每 50 mL 发酵液），初始 pH 值为 6.0～7.0， 装液量 50 mL（每 250 mL 三角瓶），转速 160rpm，发酵时间 120h。在上述实验条件下 enniatinns 总产量可达 88.68 mg·100mL-1，从正交试验结果分析当中看出，如果适当增加 通气量，产量可望更高。