乳腺炎细胞因子及T淋巴细胞亚群研究

乳腺炎是乳腺在病原微生物感染后发生的炎症性反应过程，是机体免疫系统对病原的免疫应答反应，从而清除乳腺内的病原菌，充分的认识乳腺免疫防御机制有助于制定乳腺炎预防和控制措施。病原微生物感染乳腺后，能够诱导乳腺局部和全身性的免疫应答反应，产生大量的细胞因子和活化的免疫细胞，T淋巴细胞及其效应细胞因子在其中发挥着重要的作用。然而，乳腺炎症过程中，机体和乳腺组织T及其效应细胞因子的免疫应答反应还未见系统性研究报道。因此，本研究以奶山羊和C57BL/6小鼠建立乳腺炎模型，通过ELISA、实时荧光PCR、流式细胞术等对乳腺炎天然免疫阶段的细胞因子及其淋巴细胞亚群的动态变化进行了系统性的研究。 1.奶山羊乳腺炎血清和乳汁细胞因子动态变化 E. coli或S. aureus感染奶山羊乳腺后4h、8h、24h、48h和72h，乳汁IL-1β、IL-6、IL-17和TGF-β含量均明显升高，但E. coli组的细胞因子出现升高的时间和速度均早于并快于S. aureus组，即2种细菌引起乳汁细胞因子变化趋势有所不同，表明S. aureus和E. coli诱导乳腺IL-1β、IL-6、IL-17和TGF-β等细胞因子的分泌，从而增强乳腺免疫防御能力和病原微生物的清除能力。然而，血清中4种细胞因子的含量均显著性变化，说明乳腺局部的细胞因子的研究在乳腺免疫和乳房炎防控中具有更为重要的意义。 2.小鼠隐性乳腺炎血清细胞因子和脾脏淋巴细胞的动态变化 对照小鼠和经鉴定为隐性乳腺炎的小鼠于2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h和72h时摘眼球采血处死，分离血清和脾脏淋巴细胞，分别通过ELISA和流式细胞技术检测血清中IL-6、IL-17、TGF-β含量和淋巴细胞亚群的动态变化。 与对照小鼠相比，S.aureus感染后8～24h试验小鼠血清中IL-17含量升高，48h、60h降低。淋巴细胞分析显示脾脏IFN-γ+T细胞、Th1细胞、IL-17+T细胞、Th17细胞均在感染后升高，然而脾脏IFN-γ+γδ T细胞和IL-17+γδ T细胞均无显著性升高，且在多个检测时间点低于对照小鼠。结果表明S. aureus引起小鼠隐性乳腺炎早期阶段，介导小鼠循环系统存在免疫反应是Th1和Th17细胞，而不是IFN-γ+和IL-17+γδ T细胞。 3.小鼠隐性乳腺炎乳腺组织细胞因子和淋巴细胞动态变化 对照小鼠和经鉴定为隐性乳腺炎的小鼠于2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h和72h时处死，对乳腺组织局部的免疫反应做了系统的研究。 结果显示S. aureus感染后乳腺IFN-γ mRNA表达水平升高，然而与对照小鼠相比，乳腺组织Th1细胞和IFN-γ+γδ T细胞均无显著性升高，且在后期出现显著的降低。同时，IL-12和转录因子T-bet的基因表达出现明显的降低。 S. aureus感染后乳腺组织IL-17mRNA显著的升高，其动态变化与乳腺组织的IL-17分泌细胞IL-17+T细胞相一致，进一步分析显示乳腺组织的IL-17+T细胞主要是Th17细胞和IL-17+γδ T细胞，结果表明Th17细胞和IL-17+γδ T细胞在介导乳腺组织炎症反应和S. aureus清除中具有关键的作用。 IL-1β、IL-6、IL-23、TGF-β等细胞因子不仅是重要的炎性介导分子，而且能够促进IL-17分泌细胞的发育分化，并与IL-17协同作用促进局部的炎症反应和病原的清除，本试验结果显示IL-1β、IL-6、IL-23、TGF-β的表达均显著的升高，说明S. aureus感染后乳腺组织具有IL-17分泌细胞发育分化的细胞因子微环境，促进了IL-17的分泌，同时转录因子RORγt基因表达的升高也确证了这一点。 结论 （1） S. aureus、E. coli感染奶山羊乳腺后，外周免疫系统细胞因子无明显变化，而腺组织局部表现为IL-17及IL-17相关的IL-6、IL-1β和TGF-β等多种促炎性和调节性细胞因子的迅速升高，提示IL-17可能在乳腺局部炎症中具有重要作用，然而IL-17在乳腺免疫中的作用还有待通过模型动物进行深入的研究。 （2） IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23、TGF-β在介导乳腺抗S. aureus感染的天然免疫中具有重要的炎症介导和调控作用，乳腺低水平IL-10有助于炎性细胞分化和促炎性细胞因子的分泌，从而促进乳腺炎症反应。 （3） S. aureus诱导的小鼠隐性乳腺炎模型中，感染的早期（36h）脾脏Th1细胞和Th17细胞存在显著性变化，介导小鼠全身性炎症反应，然而循环系统γδ T细胞在整个感染期间均无明显变化，说明γδ T细胞无全身性的炎症介导作用。 （4） IL-17在乳腺组织局部存在显著性变化，且与IL-17分泌细胞相关的细胞因子（IL-6、IL-23、TGF-β、IL-1β）、转录因子RORγt、表面标志分子CCR6等呈现相似的变化趋势，表明IL-17是关键的乳腺炎症介导分子之一，乳腺组织免疫细胞亚群的分析结果显示其来源是活化的Th17和IL-17+γδ T细胞。