研究表明,脑血管闭塞以后,缺血区出现血管增生,其增生的范围和程度直接关系到半暗带血流的改善,影响神经元生理功能的恢复除对缺血区现有的微血管结构功能的完整性给予保护之外,还需促进治疗性血管的新生以加强对缺血区的血流供应,挽救损伤的脑组织。脑缺血后的血管新生可被一系列血管生长因子调节。血管生成生长因子具有正性调控作用,包括内皮细胞特异性的血管内皮生长因子(VEGF)家族、血管生成素(Ang)家族等。VEGF/VEGFR系统可能在启动血管新生中发挥关键性作用,是整个脑缺血后血管新生调控的中心环节。而Ang及其受体家族被认为是最重要的血管稳定因子,它们抑制血管内皮系统(ECS)的增殖。
脑缺血再灌注会导致脑微血管内皮细胞功能受损,通透性明显增高,血脑屏障严重破坏,是引起脑水肿最常见原因之一,研究对脑微血管内皮细胞具有保护作用的药物及方法具有重要的临床意义。
中医学认为缺血性脑血管疾病属于“中风病”、“卒中”等范畴。我们认为中风的病机为气血失和、脑络失养,因此提出和血生络法治疗中风的观点,以人参养荣汤化裁为和血生络方,在临床当中治疗缺血性脑血管病取得了良好的疗效。
目的:将和血生络方用于大鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO/IR)模型,观察其对对脑组织血管生成生长因子、血管生成素-1(Ang-1)及其受体(Tie-2)表达、大鼠神经功能评分和脑含水量的影响,探讨和血生络方对缺血性脑损伤后血管新生作用及其机制,同时观察其对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞活性、VEGFmRNA的影响,为和血生络方治疗脑梗塞提供实验依据。
方法:研究内容共分四部分。
第一部分:和血生络方对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织微血管密度和血管内皮生长因子的影响
健康Wistar大鼠,体重250～300g。将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、和血生络方组,参照文献,后两组线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模(MCAO/IR)模型,大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(350mg/kg体重)麻醉,仰卧固定于手术台上,颈部正中切口,暴露分离右侧颈总动脉(CCA)和颈外动脉(ECA) ,结扎CCA ECA根部及分支。用动脉夹夹闭CCA远心端,在CCA近分叉处剪一小口,经此插入直径0.2mm头端圆钝的渔线,插入深度为18.5±0.5mm。结扎颈总动脉,缝合皮肤。2h后抽出尼龙线栓,建立脑IR模型。假手术组只分离、暴露血管,不结扎颈总动脉及颈外动脉,不插入尼龙鱼线。参照Zea Longa 5分评分标准: 0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向外侧转圈;3分:向对侧倾斜;4分:不能自发行走,意识丧失。1～3分大鼠为合格,进入实验。
各组大鼠届时以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,打开胸腔,经心脏灌注0.9%的生理盐水,续之以4%多聚甲醛灌流固定。剥取脑组织,以视交叉到枕叶处两点冠状切片。
免疫组化步骤:P V法染色,染色步骤按说明书进行,VIII因子、VEGF的浓度均为1:100,DAB显色。胞浆有棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞。
微血管密度:凡染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞族作为一个血管计数,参照Weidener计数方法,计算出每1 mm2面积内微血管的数量,即微血管密度,然后求其均值。
数据采用均数±标准差( x±s)表示,用SPSS for Windows 10.0统计软件处理,组间两两比较用q检验,显著性差异水平以0.05和0.01为标准。
第二部分:和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠血管生成素-1及其受体表达的影响
动物分组、造模方法及免疫组化步骤同上。
第三部分:和血生络法对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞活性和VEGFmRNA的影响
大鼠脑微血管内皮细胞的培养:取1周内W istar大鼠,无菌条件下取出大脑,放入预冷D hank′s液中,剥离软脑膜、大血管及大脑髓质,用眼科剪将大脑皮质剪碎成1mm3的小块,移入匀浆器中匀浆,将匀浆液依次通过100目和200目尼龙网过滤,收集200目尼龙网上的微血管段。用0.2%胶原酶37℃消化20min。离心所得沉淀用DMEM液悬浮后,接种于明胶预先包被的培养瓶中,37℃,5%CO2培养箱中静置培养。
本实验用第3代细胞,分为正常组及缺氧组,缺氧组建立缺氧模型:将细胞移入厌氧培养箱中(37℃,95%N2,5%CO2)造成缺氧模型。和血生络方组在造模时分别给予大、中、小剂量的和血生络方中药;采用MTT法测定各组细胞活性,用RT-PCR方法测定VEGFmRNA。
第四部分:和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分和脑含水量的影响
1大鼠一般状况的比较:和血生络方能显著改善脑缺血再灌注后大鼠的一般状况:明显改善大鼠的活动、皮毛光泽度、饮食等状况。
2神经功能评分:采用Longa 5分评分神经功能评分标准对各组脑缺血再灌注后大鼠进行经功能评分。
3脑含水量的测定:动物处死后,取出全脑,去除嗅脑,低位脑于及小脑,立即称取脑湿重,后置于90℃烤箱将组织块烤至恒重,测干重。计算脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。
结果:
第一部分:和血生络方对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织微血管密度和血管内皮生长因子的影响
1和血生络方对脑缺血大鼠后微血管密度的影响
正常组和假手术组MVD比较差异无统计学意义。自7天开始,模型组与和血生络方组缺血周边区微血管计数明显增多。和血生络组皮层缺血周边区微血管计数又明显多于模型组。
2和血生络方对脑缺血大鼠VEGF表达的影响
正常组和假手术组VEGF表达较弱。模型组第1d时见少量VEGF表达,与正常组相比,3d后模型组VEGF阳性细胞数逐渐增多。与模型组比较,和血生络方组阳性细胞数更多(P<0.01),第7d时,阳性细胞数达到高峰,表达细胞主要为神经胶质细胞、神经细胞及血管内皮细胞。在14d时模型组与和血生络方组VEGF表达开始下降,在第21d时仍有阳性细胞表达,仍未恢复到正常水平。
第二部分:和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠血管生成素-1及其受体表达的影响
正常组和假手术组Ang-1表达较弱。模型组第1d时见少量表达,与正常组比较,3d后模型组Ang-1阳性细胞数逐渐增多。与模型组比较,在14d时和血生络组Ang-1阳性细胞数明显增多。Tie-2的表达特点与Ang-1相似。
第三部分:和血生络法对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞活性和VEGFmRNA的影响
1和血生络方对缺氧后脑微血管内皮细胞活性的影响
与正常组比较,模型组细胞活性明显下降(P<0.01) ,表明缺氧可诱发内皮细胞造成比较严重的损伤。与模型组比较,和血生络方各剂量组细胞活性均明显增强(P<0.01)。
2和血生络方对缺氧后脑微血管内皮细胞VEGFmRNA的影响
与正常组比较,模型组细胞VEGFmRNA明显增高(P<0.01)。与模型组比较,和血生络方后小剂量、中剂量VEGFmRNA的表达增强(P<0.05)。大剂量组增高更明显(P<0.01)。
第四部分:和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能和脑含水量的影响
1和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响
正常组与假手术组大鼠的神经行为学表现正常,评分均为0分。模型组神经学评分多数为2分以上。与模型组比较,和血生络方组在第7天时评分明显降低(P<0.01)。
2和血生络方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响
模型组3 d时的脑含水量达到高峰,在7d时脑含水量仍未恢复正常。与模型组比较,和血生络方组的脑含水量在3d和7d时明显下降(P<0.05, P<0.01)。假手术组的脑含水量与正常组比较均无明显差异,表明手术本身对大鼠脑含水量无明显影响。
结论:
1和血生络方可使脑缺血周边区MVD表达增强,使血管数目增多。可促进VEGF表达,第7d时,阳性细胞数达到高峰,表达细胞主要为神经胶质细胞、神经细胞及血管内皮细胞。提示有促进缺血区的血管新生的作用。
2和血生络方可提高Ang-1和Tie-2表达,有促进缺血区的血管新生的作用,14d时表达最强,在血管形成后期具有非常重要的作用。
3和血生络方可提高缺氧脑微血管内皮细胞活性和VEGFmRNA的表达,这可能是和血生络方对缺氧的脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。
4和血生络方可改善局灶性脑缺血大鼠神经功能评分,减轻脑含水量,抑制脑水肿高峰的形成,提示和血生络方组可明显减轻脑缺血大鼠神经损伤,对脑缺血再灌注具有保护作用。
