西洋参有效部位诱导肿瘤细胞凋亡及其分子机制研究

从西洋参茎叶中提取、转化、分离出人参抗癌有效部位(Panaxquinquefolium L'effective parts, PQEP),主要包括Rg3、Rh2、20(S)-原人参三醇(Protopanaxtriol PPT)、20(S)-原人参二醇(ProtopanaxdiolPPd)等成分,就其抑制肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡及其分子生物学机制等方面进行深入探索,为研究与开发中药治疗肿瘤提供科学依据。主要研究内容如下: 1.采用小鼠移植性S180肉瘤模型,观察PQEP给药后对小鼠肿瘤重量的影响;应用HE染色、免疫组织化学染色、DNA Ladder、流式细胞仪等方法观察PQEP对小鼠移植性肿瘤细胞凋亡的影响。结果表明PQEP能够明显抑制小鼠移植性肉瘤S180的生长。同时,在S180组织细胞DNA电泳图中发现有DNALadder条带出现。流式细胞仪检测结果也提示S180肿瘤细胞发生明显凋亡,而且统计学分析凋亡率与剂量呈依赖关系。小鼠移植性肉瘤S180PCNA免疫组织化学染色结果显示,随着PQEP给药剂量的增加,PCNA标记指数(PCNALI)逐渐降低,实体瘤体积也减小,表明PQEP在体内可显著抑制肉瘤S180细胞增殖。 2.体外培养S180肿瘤细胞,采用DNA Ladder、流式细胞术观察PQEP对S180细胞周期及凋亡率的影响;Real time RT-PCR和免疫组化分析PQEP对S180肿瘤细胞bcl-2、bax mRNA和蛋白表达的影响。结果表明,PQEP能够明显诱导S180肿瘤细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,能够明显降低bcl-2的表达,同时促进bax的表达。 3.体外培养人白血病K562细胞,采用荧光染色、DNA Ladder、流式细胞术观察K562细胞凋亡;RT-PCR和免疫组化观察PQEP对细胞周期相关调节基因PCNA、CyclinD1、P21和P27的影响;流式细胞术观察PQEP对K562细胞线粒体膜电位(△Ψmt)的影响;激光共聚焦显微系统观察PQEP对K562细胞内钙的影响;Real time RT-PCR和免疫组化分析PQEP对K562细胞bcl-2、bax表达的影响;流式细胞仪免疫荧光分析PQEP对K562细胞Fas表达的影响;Western blot分析PQEP对K562细胞多聚聚合酶(PARP)蛋白表达的影响。结果表明,PQEP能够明显诱导K562细胞发生凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,并能强有力促进周期素抑制因子P21和P27的表达,降低PCNA和CyclinD1的表达;PQEP能够降低△Ψmt和促进细胞内[Ca2+]i升高,能够使bcl-2蛋白表达下降,bax蛋白表达增加,能够激活下游caspase-3并裂解其底物PARP;同时,可上调细胞膜上Fas抗原的表达。说明PQEP能够使肿瘤细胞堆积于G0/G1期,进而通过线粒体和死亡受体两个主要途径来完成抑制肿瘤细胞分裂增殖而杀死肿瘤细胞的全过程。