黄芩苷抑制血小板源性生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖机制研究

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）增殖是动脉粥样硬化、冠状动脉血管成形术后再狭窄等心血管疾病共同的病理基础。抑制VSMC异常增殖是逆转血管病变及防治心血管疾病的根本措施之一。黄芩苷,是唇形科植物黄芩的有效成分之一,属黄酮类化合物,具有清除氧自由基、改善微循环、扩张血管、保护心肌细胞、抗心律失常等多方面功效。但是,黄芩苷调节心血管功能、抗动脉粥样硬化的作用机制尚不清楚。本研究观察了黄芩苷对血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）诱导的VSMC增殖、迁移的影响以及对细胞周期的干预作用,并对其抗增殖的分子机制进行了深入探讨,为黄芩苷在血管病变防治中的应用提供新的实验依据。 方法: 1 VSMC的培养及分组 用贴块法分离、培养VSMC,取3 ~ 6代细胞进行实验。传代培养的VSMC生长至60 % ~ 70 %汇合时,给予用不同浓度黄芩苷（5、10、20、40μmol/L）预孵育后,加PDGF刺激24 h。 2伤口愈合实验 将VSMC接种于玻片上,至100 %汇合后用无菌枪头在玻片上划痕。细胞分组与处理条件同上。取出玻片,于低倍镜下观察细胞伤口愈合情况。 3免疫细胞化学染色 各组VSMC用多聚甲醛固定,Triton X-100处理后与相应的一抗及二抗反应,DAB显色。镜下观察,计数阳性染色细胞。 4流式细胞术分析 各组VSMC制备成单细胞悬液,乙醇固定过夜。加荧光染料后,过滤,流式细胞检测仪检测细胞周期分布情况。 5 Western blot分析 取等量蛋白的提取液上样,进行SDS-PAGE,电转移至PVDF膜上,随后与相应的一抗及二抗反应,用化学发光法检测抗原抗体结合区带。用数码成像分析系统软件对结果进行相对定量分析。 结果: 1黄芩苷抑制PDGF诱导的VSMC增殖细胞计数分析结果表明,黄芩苷能以浓度（5、10、20、40μmol/L）依赖的方式抑制VSMC增殖,具有明显量-效关系。免疫细胞化学和Western blot分析显示,正常细胞中细胞增殖标志物PCNA呈低水平表达,PDGF （10 ng/ml）刺激后PCNA水平大幅度升高,而药物孵育则使PCNA水平下降（P<0.05）,与细胞计数结果一致。提示黄芩苷具有抑制PDGF诱导的VSMC增殖的作用。 2黄芩苷抑制PDGF诱导的VSMC迁移 伤口愈合实验结果显示,黄芩苷明显抑制PDGF诱导VSMC的迁移活性。免疫细胞化学染色显示,黄芩苷抑制PDGF诱导的粘附分子VCAM-1、ICAM-1的表达。Westernblot分析也显示,黄芩苷可剂量依赖性地抑制PDGF诱导的VCAM-1、ICAM-1、MMP-2和OPN的高表达（P<0.05）。以上结果提示黄芩苷抑制PDGF诱导的VSMC迁移作用与抑制迁移相关蛋白的表达有关。 3黄芩苷阻滞PDGF诱导的VSMC细胞周期进程 流式细胞术分析显示,黄芩苷（5、10、20、40μmol/L）预孵育VSMC 24 h,PDGF诱导的细胞周期进程被阻滞于G0/G1期,处于G0/G1期的细胞数较PDGF组分别增加了5 %、19 %、25 %和29 %;在此基础上,又检测了黄芩苷（20μmol/L）预孵育不同时间（12 h、24 h、48 h）对PDGF诱导的VSMC细胞周期的影响,结果显示,随着预孵育时间的延长,G0/G1期的细胞数明显增加（P<0.05）。 4黄芩苷可抑制cyclinE和CDK2的表达和相互作用Western blot分析显示,黄芩苷抑制cyclinE和CDK2的表达,具有明显量-效关系（P<0.05）。免疫共沉淀分析表明,黄芩苷在5、10、20、40μmol/L的浓度范围内,可剂量依赖性地抑制cyclinE-CDK2复合物的形成;与此同时,p27的表达量逐渐升高。提示黄芩苷阻滞VSMC细胞周期进程与抑制cyclinE、CDK2表达及相互作用和上调p27表达有关。 结论: 1黄芩苷抑制PDGF诱导的VSMC增殖。 2黄芩苷可通过下调迁移相关蛋白的表达而抑制PDGF诱导的VSMC迁移。 3黄芩苷使PDGF诱导的VSMC细胞周期进程停滞于G0/G1期。 4黄芩苷对VSMC增殖的抑制作用与其抑制cyclinE、CDK2的表达及相互作用和上调p27表达有关。