秸秆腐熟菌剂的细菌种群分析及其腐熟过程的动态研究

本论文以秸秆腐熟菌剂为研究对象，分别采用分子生物学方法和传统平板分离方法对其细菌菌群及在腐熟过程中的变化进行分析。采用构建16S rDNA克隆文库的方法比传统平板分离方法能够更加客观、准确的反应腐熟剂样品中细菌组成，PCR—DGGE技术是目前研究接种微生物在腐熟过程中动态变化的理想方法之一。本论文研究可为秸秆腐熟菌剂的菌种合理组成、菌剂生产与应用提供依据。论文的主要结果如下。 采用构建16S rDNA克隆文库的方法研究了目前广泛应用的样品A和B的细菌组成，结果表明样品A主要是融合乳杆菌(WeisseUa confusa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)；而样品B主要是布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)和耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)。对比平板分离法，采用构建16S rDNA文库的方法得到的结果更全面，也更好反映出样品中的细菌组成。 DGGE分析样品田间应用取样结果表明，堆沤和凼沤这两种发酵方式的优势微生物存在较大的差异。但是都是堆沤方式的两个样品的DGGE图谱则非常相似。目的条带测序结果与产品建库测定结果相比较，测序结果均非所加秸秆腐熟剂B样品的优势细菌。 将样品A和B接种水稻秸秆小型堆肥中，采用DGGE的方法和平板培养的方法分析堆肥中的微生物动态变化，并测定堆腐过程中的温度、pH值、含水量、C／N、种子发芽率等参数。实验结果表明，添加秸秆腐熟剂可以促进堆肥顺利进行；堆肥中微生物发生明显演替，首先是乳酸菌和常温细菌大量繁殖，促进堆温升高，进入高温期后高温放线菌和高温细菌快速繁殖，在腐熟后期堆温下降后，常温菌又重新繁殖。采用DGGE图谱分析其过程中优势微生物，结果表明堆腐过程中不同时期是不同优势菌种扮演重要角色以促进秸秆顺利腐熟。并且目的条带测序结果表明，堆肥中优势菌种大多为目前不可培养微生物，并非添加样品中所含优势微生物。 本研究表明：16S rDNA克隆文库法和DGGE法可以用于微生物菌剂中的细菌组成分析，快速准确检测菌剂质量，这对于微生物菌剂质量的提高，推进微生物肥料行业的可持续发展具有重大意义；堆肥过程是由多个不同菌群主导的接力过程，腐熟剂对初期的腐熟温度的提高起到关键作用，随着腐熟进程的深入，微生物菌群发生了更替。 Bead-beader的方法适合大批量DNA的提取。DGGE的方法分析复杂微生物样品需要通过垂直电泳先确定变性剂浓度的大致范围。