南极海洋菌Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖诱导人乳腺癌细胞凋亡的研究

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌细胞已经失去了正常细胞的特性,细胞和细胞之间的连接松散,细胞容易脱落,游离的癌细胞会随着血液和淋巴液扩散至全身,危及生命。近年来我国乳腺癌发病率呈增长趋势,乳腺癌已经成为了威胁女性身心健康的一种常见肿瘤。乳腺癌的治疗方法主要为外科手术、放疗、化疗等方法,这些方法对于人体都有一定的伤害。所以寻找一种对机体副作用小,能够抑制恶性肿瘤的物质,是抗肿瘤研究的新思路。 本课题组前期已经完成南极海洋菌Pseudoaltermonas sp.S-5胞外多糖的分离纯化及其单糖组成等测定工作。还发现南极海洋菌胞外多糖具有很好的免疫活性,而本文研究了PEP体外抑制肿瘤细胞的增殖活性和其诱导人乳腺癌细胞凋亡的机制。 1.用MTT法对南极海洋菌S-5胞外多糖PEP体外抑制肿瘤细胞增殖的作用进行了评价。以不同浓度的PEP处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞24h、48h之后,发现肿瘤细胞的增殖受到抑制。处理24h后,抑制率由2.06%逐渐增加为42.5%,用浓度为1.0mg/mL的PEP处理肿瘤细胞48h后,抑制率达到44.5%。 2. Hoechst33342染色方法观察南极海洋菌S-5胞外多糖处理乳腺癌细胞后细胞形态的影响。不同浓度的PEP处理乳腺癌细胞24h之后,进行染色,染色后在荧光显微镜下观察并拍照。对照组的细胞形态一致,染色均匀,呈现出微弱的蓝色荧光；而经过PEP处理后的细胞,出现呈颗粒状强蓝荧光的细胞核,并且随着胞外多糖浓度的增加,数量逐渐增多。进一步用Annexin V-FITC/PI染色方法进行确认,结果显示,随着南极海洋菌胞外多糖PEP浓度的不断增加,发生早期凋亡的乳腺癌细胞明显增加,1.0mg/mL PEP处理时,早期凋亡达到了15.82%。说明磷脂酰丝氨酸由内膜翻转到了外膜,肿瘤细胞发生了凋亡。 3.为了探究细胞凋亡的机制,使用DCFH-DA荧光探针来检测胞内活性氧的产量,用JC-1荧光探针来检测线粒体膜电位的变化,用Fluo-3/AM荧光探针来检测细胞内钙离子浓度的变化。结果发现PEP处理MDA-MB-231细胞后,细胞内活性氧的产量增加,线粒体的膜电位下降,细胞内钙离子的浓度升高。这些结果均表明线粒体途径参与了PEP诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡。 4.为了进一步探究PEP诱导人乳腺癌细胞凋亡的机制与相关基因的关系,通过RT-PCR方法检测PEP处理MDA-MB-231细胞后p53、Bcl-2、Bax、FasL和Fas的mRNA的表达量的变化；采用实时定量PCR方法检测内质网凋亡途径CHOP、GRP78、Calenexin、ATF4、ATF6、Caspase3、Caspase12等基因表达量的变化。通过RT-PCR实验结果可以发现,Bcl-2的mRNA的表达量随着PEP浓度的升高不断降低,而p53和Bax的mRNA的表达量刚好相反；FasL和Fas的mRNA表达量不断增加。结果证明了线粒体途径参与了PEP诱导人乳腺癌细胞的凋亡。同时,死亡受体途径也参与了肿瘤细胞的凋亡。通过实时定量PCR的结果可以发现,CHOP及Caspase12基因的表达量随着PEP浓度的增加而逐渐增加,表明内质网途径也参与了PEP诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡。 以上研究结果表明PEP能够通过Fas介导的细胞膜受体途径和线粒体途径以及内质网途径诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞凋亡。本研究为PEP在诱导乳腺癌的治疗方面提供了一定数据支持和理论依据。