FMR1基因敲除小鼠听源性癫痫的生化机制及其柴胡桂枝汤挥发油的干预作用

目的 癫痫是神经系统常见病之一,是由多种病因引起的慢性脑性疾病,以大脑神经元突发性异常放电所致的突然、反复和短暂的大脑功能障碍为特征,是影响人类健康的一大类疾患。这种神经元的异常放电与神经递质失衡、离子通道、神经胶质细胞、遗传及免疫的异常有着密切的关系。目前对癫痫的实验研究,多采用传统的点燃模式—化学点燃。化学点燃的药物主要有戊四氮、匹罗卡品、青霉素及美解眠等。 临床上对癫痫的治疗,大多都是使用西药来控制癫痫的发作,但常用的西药均具有明显的毒副作用。中药治疗癫痫具有疗效确切、毒副作用少等优势。柴胡桂枝汤在临床上具有明显的抗癫痫作用,但机理不明。明确癫痫发病机制,将有利于癫痫的诊断、预防与治疗。 本实验拟用FMR1基因敲除小鼠作为模型,从空间认知功能、突触重建、动物行为学、自由基产生与消除、氨基酸水平等方面,研究癫痫发病机制及柴胡桂枝汤对癫痫的干预作用,为该组方将来开发成为新型的抗癫痫药物打下坚实的实验研究基础。 方法 1.FMR1基因敲除小鼠癫痫模型的初步研究选择4周、6周、8周不同年龄组的正常的野生型小鼠(WT)和FMR1基因敲除小鼠(KO),以相同实验条件进行5天的Morris水迷宫学习与记忆测试,包括前4天的定位航行实验和第五天的空间探索实验。 选择0天、2周、4周不同年龄组的正常的野生型小鼠(WT)和FMR1基因敲除小鼠(KO),用免疫组化的方法观察EphA2在两种鼠脑不同部位的表达。2. FMR1基因敲除小鼠听源性癫痫及柴胡桂枝汤挥发油抗癫痫生化机制的研究选择4周龄的正常的野生型小鼠(WT)和FMR1基因敲除小鼠(KO),腹腔注射不同浓度的柴胡桂枝汤挥发油,运用旷场实验方法,观察动物行为学的指标及建立一个有效药物浓度曲线。 将4周龄的WT和KO小鼠分别分作三组,即未作任何处理的对照组、腹腔注射植物油的空白组、腹腔注射柴胡桂枝汤挥发油的用药组。利用邻苯三酚自氧化法、硫代巴比妥法、硝酸还原酶法分别检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的水平,以用来比较三组不同处理的小鼠这三种物质水平的改变。 与此同时,我们还采用高效液相色谱的方法来检测三组不同处理的小鼠氨基酸水平的变化,以更全面地研究癫痫发病机制。3.柴胡桂枝汤挥发油成分气相色谱-质谱分析 利用超临界CO2萃取技术制备柴胡桂枝汤挥发油,并用气相色谱-质谱方法对其进行分析和鉴定。 结果 1. Morris水迷宫试验结果 在定位航行实验中,4、6、8周龄FMR1基因敲除小鼠(KO)的逃避潜伏期与同周龄野生型小鼠(WT)相比有差异,较同周龄野生型小鼠逃避潜伏期延长( P < 0.05)。同时,4、6、8周龄小鼠在空间探索实验中,穿过平台次数的比较,KO组明显少于WT组;停留在平台区域所用时间的比较,KO组也明显短于WT组( P < 0.05)。 2. EphA2在鼠脑中表达的结果 EphA2蛋白在新生小鼠的海马、皮层表达丰富。海马以阳性细胞为主,尤其是CA3区阳性细胞表达显著;皮质则是有阳性细胞和阳性纤维双重表达。在0天、2周、4周不同年龄组的小鼠中,KO组小鼠EphA2在海马和皮质的表达,明显高于WT组小鼠。(P < 0.05)。 3.旷场实验的结果 未用药的WT组和KO组小鼠比较,KO组小鼠的运动性、兴奋性、探索性明显高于WT组小鼠。随着柴胡桂枝汤挥发油浓度的增加,KO和WT小鼠的平均速度、运动轨迹及穿越中央格次数均逐渐降低。 4. SOD、MDA、NO水平测定的结果 WT空白组小鼠与WT对照组小鼠比较,WT空白组小鼠的SOD活力、MDA和NO水平均增高;WT用药组小鼠与WT空白组小鼠比较,WT用药组小鼠的SOD活力增高,而MDA和NO水平均降低。(P<0.05) KO空白组小鼠与KO对照组小鼠比较,KO空白组小鼠的SOD活力降低,而MDA和NO水平均增高;KO用药组小鼠与KO空白组小鼠比较,KO用药组小鼠的SOD活力增高,而MDA和NO水平均降低。(P<0.05) 5.氨基酸水平的测定结果 WT空白组小鼠与WT对照组小鼠比较,WT空白组小鼠脑组织中γ-氨基丁酸水平和甘氨酸明显降低,而谷氨酸水平则明显升高;与此同时WT空白组小鼠与WT用药组小鼠比较,WT空白组小鼠脑组织中谷氨酸水平明显高于WT用药组(P<0.05) KO空白组小鼠与KO对照组小鼠比较,KO空白组小鼠脑组织中γ-氨基丁酸水平明显降低;与此同时KO空白组小鼠与KO用药组小鼠比较,KO空白组小鼠脑组织中谷氨酸水平明显高于KO用药组(P<0.05) 6.柴胡桂枝汤挥发油的气相色谱-质谱分析(GC– MS)结果 经GC - MS分析,确定并鉴定出了其中的28种组分。其中,挥发油组分中,最主要的成分姜辣素占31. 94% (其中姜烯占19.75%、α-姜黄烯占7.36%、顺式-6-姜烯酚占4.83%),丁香酚占18. 01% ,单萜类物质占12.34%(其中β-倍半水芹烯占7.98%、β-红没药烯占3.90%、α-可巴烯占0.46%),3-丁基-1(3H)-异苯并呋喃酮(又名丁基苯酞)占9. 34% ,肉桂类物质占8. 03%。 结论 1.本实验采用的FMR1基因敲除癫痫小鼠模型类似人类的癫痫发作,且具备学习和记忆能力缺损,是研究癫痫比较理想的动物模型。EphA2受体是一种轴突导向分子,可能参与了脑组织结构轴突出芽和突触重构的过程,为FMR1基因敲除小鼠易发癫痫提供了一条新的思路。 2. FMR1基因敲除小鼠听源性癫痫可能与兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸的比例失衡相关,同时大量自由基的产生、过氧化物生成及NO神经毒性也可能在致痫过程中起到了一定的作用。 3.柴胡桂枝汤挥发油的抗癫痫作用可能与降低兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸的比值有关,再者其有效清除自由基、阻止过氧化物生成,减少NO的神经毒性等药理作用,在一定程度上,能减少癫痫发作的次数,具有保护脑细胞的作用。 4.柴胡桂枝汤挥发油中姜辣素、单萜类物质、丁基苯酞、丁香酚等主要成分可能在柴胡桂枝汤挥发油的抗氧化与抗癫痫的过程中起到了一定的作用。