黄芩苷对类风湿关节炎模型小鼠的治疗作用和机制

虽然对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)病因学的探索、发病机制的研究、诊断和治疗的临床实践已经经历了漫长的过程,但无论在病因学和发病机制方面,还是在诊断和治疗方面,目前仍存有众多的疑问,而且RA不仅会严重影响患者的生活质量,甚至会缩短患者的预期寿命。RA的发病率为0.5%-1%,女性多见。该病引起关节软骨及骨进展性破坏,致残致畸率高,同时伴有心肺血管代谢及心理异常等合并症。初发患者以对称性的外周关节受累为主要表现,随着疾病的进展出现关节功能的障碍,失去劳动能力。疾病后期因慢性炎症引起心肺血管及代谢性并发症导致死亡。在发病因素方面,RA的遗传结构已经通过传统的和全基因组的方法得到了较多的认识。100多个位点与该病的风险和进展有关,其中大部分涉及基因调节和免疫效应的产物。吸烟、肺部感染、维生素D(vitamine D,VitD)缺乏、肥胖以及胃肠道菌群失调等因素改变了自体的免疫耐受。在异常免疫反应的作用下,产生自身抗体,这是人们所认识到的RA发病的重要原因。RA没有治愈的方法。一直以来是全球风湿病专家面临的一个难题。用于RA的一线药物有非甾体抗炎药和糖皮质激素,它们仅仅缓解关节的肿胀及疼痛,对疾病的进展没有作用。用于RA的二线药物为控制病情慢作用抗RA药,但是这些药物普遍存在起效慢,副作用大的缺点,并且患者用药后个体差异很大。虽然靶向作用于TNF-α和IL-6的生物制剂,疗效显著,但是仍有30%-40%的患者治疗反应不佳,而且有生物制剂固有的副作用,因此,对有些RA患者的应用会受到一定的限制。黄芩是我国的传统中药,在古代就被视为黄金药材应用于多种疾病的治疗。近几年对黄芩苷(baicalin,Ba)药理作用机制的研究发现,其能够通过抑制氧化应激及IL-1β诱导的炎症因子生成减轻骨关节炎大鼠的关节损伤。黄芩苷通过抑制IL-17缓解了佐剂诱导的小鼠关节炎的炎症反应。当前缺乏关于黄芩苷对RA作用及其机制的深入探讨,作为一种潜在的治疗RA的药物,我们做了进一步的研究。本次研究中,我们应用胶原抗体和脂多糖诱导构建小鼠关节炎模型,研究黄芩苷对细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric synthase,iNOS)、环氧化酶(cyclooxygenase,COX)-2、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2/9、滑液内单核细胞凋亡以及软骨降解的作用程度。进一步探讨了其对Janus激酶1/信号传导与转录因子3(Janus tyrosine kinase 1/signal transducers and activators 3,JAK1/STAT3)及丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路的影响。以确认黄芩苷对RA的治疗作用程度及其相关机制。RA模型小鼠建立:连续10天向腹膜腔注射胶原Ⅱ单克隆抗体混合物(5mg/kg),并在第1天和第4天向腹膜腔注射胶原Ⅱ单克隆抗体混合物的同时,每只小鼠腹腔注射100μg脂多糖,建立RA模型。实验设计和分组(每组10只):(1)Ctrl组:正常小鼠腹膜腔注射0.9%NaCl(30mg/kg),持续5天;(2)RA+NaCl组:从模型建立后的第1天开始,每天向腹膜腔注射0.9%NaCl(30mg/kg),共5天;(3)RA+Ba组:从模型建立后的第1天开始,每天向腹膜腔注射Ba(30mg/kg),共5天。治疗5天后,分别取小鼠眶后静脉的血液样本。麻醉状态下,取小鼠关节滑膜、滑液及软骨组织。观察的指标如下:1.观察各组小鼠的一般情况,并使用电子压力感测器分别测量小鼠建模前,建模后以及治疗5天后的压力疼痛阈值。2.在小鼠建模10天及治疗的5天期间,应用宏观评分系统对各组小鼠关节炎症进行评估。3.用ELISA分析不同实验条件下,小鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。4.Western Blot检测小鼠滑膜及滑液中 iNOS、COX-2、MMP-2、MMP-9、JAK1/STAT3、、pJAK1/pSTAT3、、p38、、JNK、、ERK1/2及 pp38、、pJNK、、pERK1/2的表达。5.免疫荧光法检测单核细胞的细胞核形态改变,流式细胞术分析其凋亡状态。6.免疫组织化学技术检测小鼠关节软骨的降解程度。本课题的研究结果如下:1.小鼠的一般情况:Ctrl组小鼠精神好,反应灵敏,爪子无红肿,皮温正常,活动正常。进食及饮水均正常。RA+Ba组小鼠活动相对较少,爪子肿胀,皮温不高,精神可,反应稍差,进食及饮水基本正常。RA+NaCl组小鼠活动明显减少,爪子肿胀明显,皮温高,精神差,易烦躁,反应差,进食及饮水减少。2.疼痛阈值测定:经Ba治疗5天,RA+Ba组与生RA+NaCl组相比,痛觉阈值有显著升高的趋势,具有显著性差异(P<0.05);但与Ctrl组相比,痛觉阈值仍处在较低的水平,具有显著性差异(P<0.01)。这表明虽然Ba具有一定的缓解疼痛的作用,并不能使小鼠的痛觉行为恢复到正常水平。3.关节炎评分:在10天的建模过程中,模型组小鼠的关节炎评分逐渐升高,第8天的评分明显升高,疾病开始发作,第10天关节炎评分达到高峰。治疗第4天及第5天RA+Ba组小鼠关节炎评分与RA+NaCl组相比,显著降低,具有显著性差异(P<0.05)。4.经Ba治疗后5天后,RA+Ba组与RA+NaCl组相比,TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.05);但与Ctrl组相比,TNF-α、IL-1β和IL-6仍然维持在较高的水平,具有显著性差异(P<0.01)。5.经Ba治疗5天后,RA+Ba组与RA+NaCl组相比,iNOS和COX-2的表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.05);但与Ctrl组相比,iNOS和COX-2仍然维持在较高的水平,差异有统计学意义(P<0.01);RA+Ba组与RA+NaCl组相比,MMP-2和MMP-9的表达水平显著下调,具有显著性差异(P<0.05)。6.单核细胞形态及凋亡分析:核凝聚是细胞凋亡的前兆。经Ba治疗5天后,RA+Ba组小鼠滑膜单核细胞的细胞核表现出更多的凝聚性,经流式细胞术分析,RA+Ba组的凋亡率显著增加。7.经Ba治疗5天后,RA+Ba组小鼠组织内虽然可见局部的炎症细胞浸润,蛋白多糖消耗及软骨侵蚀,但较RA+NaCl组的破坏性较小。8.经Ba治疗5天后,RA+Ba组与RA+NaCl组相比,pJAK1和pSTAT3的表达水平显著下调,差异有统计学意义(P<0.05);但与Ctrl组相比,仍然维持在较高的水平,具有显著性差异(P<0.01);RA+Ba组与RA+NaCl组相比,pp38的表达水平无显著性变化,与Ctrl组相比,pp38的表达上调,具有显著性差异(P<0.01);RA+Ba组RA+NaCl组相比,pJNK的表达水平无显著性变化,与Ctrl组相比,pJNK的表达上调,具有显著性差异(P<0.01);RA+Ba组与RA+NaCl组相比,pERK1/2的表达水平无显著性变化,与Ctrl组相比,pERK1/2的表达水平显著上调,差异有统计学意义(P<0.01)。本课题的研究结果表明:1.应用Ⅱ型胶原单克隆抗体混合物及脂多糖腹腔注射可以成功构建小鼠RA的动物模型,用于实验的研究。2.黄芩苷可有效降低RA模型小鼠外周血TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,具有缓解RA疾病状态的效应。3.黄芩苷能够抑制RA小鼠滑膜及滑液中iNOS和COX-2表达,并促进单核细胞的凋亡。4.黄芩苷能够降低RA小鼠滑膜及滑液中MMP-2和MMP-9蛋白表达,减轻软骨的降解。5.黄芩苷可抑制RA小鼠滑膜及滑液中pJAK1/pSTAT3信号通路的激活,但对pMAPKs(pERK1/2,pJNK和pp38)信号通路无显著影响作用。