水产品中丙酸睾酮残留检测方法的研究

丙酸睾酮作为一种人工合成的睾酮衍生物，是一种甾类蛋白质同化激素，因其具有提高饲料转化率、促进动物生长、提高产量等作用而被用于水产养殖行业。然而水产品中残留的丙酸睾酮对人体健康存在影响生长发育等很多危害，甚至有潜在的致癌性，已被许多国家限制或禁止其在食用性动物养殖中使用。但在利益的驱动下，其仍然存在被滥用的问题，因此，针对水产品中的丙酸睾酮建立可靠的检测方法进行监控是一项十分必要的措施。本文通过气相色谱质谱法和液相色谱串联质谱法两种检测手段对水产品中丙酸睾酮残留的检测方法进行了研究。 1、通过对样品前处理方法、衍生化技术、仪器测定条件等方面进行研究，首次建立了针对水产品肌肉组织中以氘代诺龙-D3为内标测定丙酸睾酮留量的气相色谱-质谱（GC/MS）方法，并对丙酸睾酮三甲基硅烷化衍生产物质谱测定时的裂解过程进行了初步的解谱推测。均质后的样品中加入内标诺龙-D3和饱和氯化钠溶液，用叔丁基甲醚超声振荡提取，经过－80℃冷冻20min脱脂，Silica固相萃取柱净化和柱前三甲基硅烷化衍生后，进行GC/MS测定。根据丙酸睾酮和内标衍生物保留时间、主要特征离子及其相对丰度进行定性；在选择离子监测（SIM）模式下，根据丙酸睾酮和内标衍生物定量离子质量色谱图的峰面积比值，采用内标法进行定量。实验结果表明，丙酸睾酮浓度在0.005μg/mL～0.2μg/mL的范围内和丙酸睾酮与内标诺龙-D3衍生物定量离子峰面积比值呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=26.81X-0.005，相关系数R2为0.9997；方法定量检测限为2μg/kg，满足药物残留检测的要求；当添加水平为1.0～10.0μg/kg时，回收率为74.1%～99.5%，相对标准偏差为3.0%～8.3%，具有良好的灵敏度和准确性。通过对鳗鲡、甲鱼两种样品的加标回收实验说明该方法适用于高脂肪含量的鳗鲡，而不适合甲鱼样品。通过对市场上8种鱼贝虾类样品的抽检，证明该方法可对样品实现灵敏、准确的定性定量分析，而第三方实验室间验证结果，进一步证明本方法是可靠的，满足对实际水产品的检测及监控的要求。 2、通过对样品提取净化条件、流动相组成和梯度、色谱质谱参数等方面的探索，首次建立了不同水产品肌肉组织中以氘代同位素诺龙-D3为内标测定丙酸睾酮残留量的液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法；同时通过对HPLC/MSQTOF色谱质谱条件的优化，建立了采用飞行时间质谱对丙酸睾酮进行确证性定性检测的方法。均质的样品中加入氘代内标诺龙-D3，采用叔丁基甲醚作为提取溶剂，用先振荡后超声再振荡的方式进行提取，离心后取上清液旋转蒸发至干，用乙腈-0.1%甲酸水溶液（9:1）复溶，在－80℃条件下冷冻30min，然后高速冷冻离心净化，过0.22μm有机滤膜后进行HPLC-MS/MS测定分析。根据丙酸睾酮和内标诺龙-D3的保留时间、主要特征子离子及其相对丰度进行定性；多反应离子监测（MRM）模式下，根据丙酸睾酮和内标诺龙-D3定量离子的峰面积比值，采用内标法定量。实验结果表明，丙酸睾酮与内标诺龙-D3的定量离子峰面积比值和丙酸睾酮与内标物的浓度比值在0.5ng/mL～100ng/mL的范围内呈线性关系，回归方程为Y=0.9964X-0.0356，相关系数R2为0.9989。方法定量检测限为0.5μg/kg，可以满足药物残留检测的要求；当在水产品中的添加水平为0.5～2.0μg/kg时，回收率为89.1%～104.5%，相对标准偏差为2.3%～5.5%，具有较高的灵敏度和准确性。该方法前处理简单快捷，对样品检测的灵敏高、准确性好，满足水产品的检测及监控的要求，可用于样品定量检测或确证性检测。