补肾复方对绝经后骨质疏松症大鼠BMP2/RUNX2/MEK1相关信号网络的调控作用

目的:通过观察去卵巢所致绝经后骨质疏松症大鼠下丘脑、肾、股骨中BMP2/RUNX2/MEK1相关信号转导通路改变，探索绝经后骨质疏松症的发病机制研究补肾复方对绝经后骨质疏松症大鼠下丘脑、肾、股骨BMP2/RUNX2/MEK1相关信号转导通路的调节作用，探讨补肾复方对绝经后骨质疏松症的防治作用机制，为后续研究补肾复方对绝经后骨质疏松症的影响及临床中医药防治绝经后骨质疏松症提供科学理论依据 材料与方法：实验选用SPF级SD雌性大鼠10周龄，按体重分层随机分组。除正常组和假手术组，其余组大鼠予摘除双侧卵巢造模假手术组只行腰背部切口切开，不摘除卵巢组织术后7天给予低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠补肾复方（鹿茸、淫羊藿提取物、牡蛎粉）灌胃，盖天力组作为阳性对照组，连续12周实验组分为正常组、假手术组、模型空白组（简称模空组）、补肾复方低剂量组（简称低剂量组）、补肾复方中剂量组（简称中剂量组）、补肾复方高剂量组（简称高剂量组）、盖天力组。用电子天平测定各组大鼠体重及大鼠子宫湿重，计算子宫指数采用双能X线骨密度仪测量大鼠左侧股骨骨密度值采用HE染色法，光镜下观察大鼠股骨的病理改变利用实时定量PCR的方法检测各组大鼠下丘脑、肾、股骨BMP2、SMAD1、RUNX2、OSX、MEK1、ERK2mRNA表达；采用Western blot方法检测各组大鼠下丘脑、肾、股骨BMP2、SMAD1、RUNX2、OSX、MEK1、ERK2蛋白表达 结果： 实验一: 1.各组大鼠左后肢离体股骨骨密度的比较，与正常组相比，模空组大鼠的股骨骨密度明显低于正常组(P＜0.01)，骨质疏松症模型成功复制用药12周后，与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组均可显著上调模型大鼠股骨骨密度水平(P＜0.05)实验组间比较，低、高剂量组高于盖天力组(P＜0.05)，但低、高剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05） 2.各组大鼠子宫指数的比较，与正常组相比，模空组大鼠的子宫指数明显低于正常组(P＜0.01)，骨质疏松症模型成功复制用药12周后，与模空组大鼠的子宫指数比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组均可上调模型大鼠的子宫指数水平，但无统计学意义（P＞0.05） 3.观察光镜下HE染色的各组大鼠右侧股骨病理切片可见正常对照组骨髓腔较小，骨小梁粗壮，形态结构完整，骨小梁表面可见成骨细胞模空组骨髓腔增大，骨小梁变窄、断裂 实验二: 1.与正常组比较，模空组大鼠血清BGP水平明显降低(P＜0.01)，说明造模成功；补肾复方低、中、高剂量组与盖天力组用药12周后，与模空组比较可显著上调大鼠血清BGP水平(P＜0.01)，但组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 2.与正常组比较，模空组大鼠血清TRACP水平显著升高(P＜0.01)，补肾复方低、中、高剂量组与盖天力组用药12周后，与模空组比较可显著降低大鼠TRACP水平(P＜0.01)；实验组间比较，高剂量组低于低剂量组、中剂量组、盖天力组(P＜0.05) 实验三: 1.各组大鼠下丘脑、肾、股骨BMP2mRNA和蛋白表达水平结果显示:在下丘脑的表达结果，与正常组比较，模空组大鼠下丘脑BMP2mRNA表达降低，但无统计学差异(P＞0.05）；用药12周后，与模空组比较，各实验组均可下调其表达情况，但无统计学差异(P＞0.05）。与正常组比较，模空组BMP2蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)；与模空组比较，低、中、高剂量组在下丘脑BMP2蛋白表达水平明显降低(P＜0.01) 在肾组织表达结果显示：与正常组比较，模空组大鼠BMP2mRNA表达降低，但无统计学差异(P＞0.05）；用药12周后，与模空组比较，高剂量组和盖天力组可上调其表达(P＜0.05)与正常组比较，模空组BMP2蛋白表达水平降低，但无统计学意义(P＞0.05）；与模空组比较，低剂量组、高剂量组BMP2蛋白表达水平升高，但无统计学意义(P＞0.05） 在股骨表达结果显示：与正常组比较，模空组大鼠BMP2mRNA表达升高(P＜0.05）；用药12周后，与模空组比较，各实验组均可下调其表达(P＜0.05）。与正常组比较，模空组大鼠BMP2蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)；与模空组比较，用药12周后，低、中剂量组BMP2蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)；与中剂量组比较，低剂量组BMP2蛋白表达水平明显升高(P＜0.01) 2.各组大鼠下丘脑、肾、股骨SMAD1mRNA和蛋白表达检测结果显示:在下丘脑表达结果显示，与正常组比较，模空组大鼠SMAD1mRNA表达降低(P＜0.05）；用药12周后，与模空组比较，各实验组均可下调其表达，但无统计学差异(P＞0.05）。与正常组比较，模空组SMAD1蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组在下丘脑中SMAD1蛋白表达水平明显降低(P＜0.01) 在肾组织表达结果显示：与正常组比较，模空组大鼠SMAD1mRNA表达升高(P＜0.05）；用药12周后，与模空组比较，低剂量组可下调其表达(P＜0.05)与正常组比较，模空组SMAD1蛋白表达水平降低(P＜0.01）；与模空组比较，高剂量组、盖天力组BMP2蛋白表达水平明显升高(P＜0.01） 在股骨表达结果显示：与正常组比较，模空组大鼠SMAD1mRNA表达明显降低，但无统计学差异(P＞0.05）；用药12周后，与模空组比较，高剂量组可明显上调其表达(P＜0.01）。与正常组比较，模空组大鼠SMAD1蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)；与模空组比较，用药12周后，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组SMAD1蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)；实验组间比较，低剂量组SMAD1蛋白表达水平明显升高(P＜0.01) 实验四: 1.各组大鼠下丘脑、肾、股骨RUNX2mRNA和蛋白表达水平结果显示:在下丘脑表达结果，与正常组比较，模空组RUNX2mRNA表达明显降低(P＜0.05)；与模空组相比，低剂量组下丘脑RUNX2mRNA表达有所升高，但无统计学意义(P＞0.05)与正常组比较，模空组RUNX2蛋白表达明显增加(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组RUNX2蛋白表达明显降低(P＜0.01) 在肾组织表达结果显示：与正常组比较，模空组RUNX2mRNA表达明显降低，但无统计学意义(P＞0.05)；与模空组相比，高剂量组RUNX2mRNA表达明显升高(P＜0.05)与正常组比较，模空组RUNX2蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组RUNX2蛋白表达明显降低(P＜0.05) 在股骨表达结果显示：与正常组比较，模空组RUNX2mRNA表达明显降低(P＜0.01)；与模空组比较，高剂量组RUNX2mRNA表达明显升高(P＜0.01)与正常组比较，模空组RUNX2蛋白表达明显降低，但无统计学意义(P＞0.05)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组蛋白表达明显升高，但无统计学意义(P＞0.05) 2.各组大鼠下丘脑、肾、股骨OSX mRNA和蛋白表达水平结果显示:在下丘脑表达结果，与正常组比较，模空组OSX mRNA表达明显降低(P＜0.05)；与模空组相比，低剂量组下丘脑OSX mRNA表达有所升高，但无统计学意义(P＞0.05)与正常组比较，模空组OSX蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组OSX蛋白表达明显升高(P＜0.01) 在肾组织表达结果显示：与正常组比较，模空组OSX mRNA表达明显升高(P＜0.05)；与模空组相比，低、中、高剂量组OSX mRNA表达明显降低(P＜0.05)与正常组比较，模空组OSX蛋白表达明显升高(P＜0.01)；与模空组比较，中剂量组、高剂量组、盖天力组OSX蛋白表达明显升高(P＜0.01) 在股骨表达结果显示：与正常组比较，模空组OSX mRNA表达明显升高(P＜0.05)；与模空组比较，低、中、高剂量组OSX mRNA表达明显降低(P＜0.05)与正常组比较，模空组OSX蛋白表达明显升高(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组OSX蛋白表达明显升高(P＜0.01) 实验五: 1.各组大鼠下丘脑、肾、股骨MEK1mRNA和蛋白表达水平结果显示:在下丘脑表达，与正常组比较，模空组MEK1mRNA表达明显降低(P＜0.05)；与模空组相比，低剂量组、高剂量组MEK1mRNA表达升高，但无统计学意义(P＞0.05)与正常组比较，模空组MEK1蛋白表达明显升高(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组、盖天力组MEK1蛋白表达明显降低(P＜0.01) 在肾组织表达结果显示：与正常组比较，模空组MEK1mRNA表达升高，但无统计学意义(P＞0.05)；与模空组相比，高剂量组、盖天力组MEK1mRNA表达升高(P＜0.05)与正常组比较，模空组MEK1蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、高剂量组MEK1蛋白表达明显降低(P＜0.05)。 在股骨表达结果显示：与正常组比较，模空组MEK1mRNA表达明显升高，但无统计学意义(P＞0.05)；与模空组相比，高剂量组MEK1mRNA表达明显降低(P＜0.05)与正常组比较，模空组MEK1蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组MEK1蛋白表达明显升高(P＜0.01) 2.各组大鼠下丘脑、肾、股骨ERK2mRNA和蛋白表达水平结果显示:在下丘脑表达，与正常组比较，模空组ERK2mRNA表达升高，但无统计学意义(P＞0.05)；与模空组相比，高剂量组ERK2mRNA表达明显升高(P＜0.01)与正常组比较，模空组ERK2蛋白表达明显升高(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组ERK2蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与低剂量组、中剂量组比较，高剂量组ERK2蛋白表达明显降低(P＜0.05) 在肾组织表达结果显示：与正常组比较，模空组ERK2mRNA表达升高，但无统计学意义(P＞0.05)；与模空组相比，高剂量组ERK2mRNA表达升高(P＜0.01)与正常组比较，模空组ERK2蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、高剂量组ERK2蛋白表达明显降低(P＜0.01)。 在股骨表达结果显示：与正常组比较，模空组ERK2mRNA表达明显降低(P＜0.01)；与模空组相比，低、中剂量组ERK2mRNA表达升高，但无统计学意义(P＞0.05)与正常组比较，模空组ERK2蛋白表达明显升高(P＜0.01)；与模空组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组ERK2蛋白表达明显升高(P＜0.01) 结论 1.正常大鼠下丘脑、肾、股骨表达BMP2、SMAD1、RUNX2、OSX、MEK1、ERK2，表明正常大鼠下丘脑、肾、股骨存在BMP2/RUNX2/MEK1信号转导网络通路 2.绝经后骨质疏松症大鼠股骨RUNX2、MEK1、ERK2mRNA表达水平降低，BMP2、OSXmRNA表达水平升高，BMP2、SMAD1、MEK1蛋白表达降低，OSX、ERK2蛋白表达水平升高；肾组织BMP2、RUNX2、MEK1mRNA表达降低，SMAD1、OSXmRNA表达水平升高，SMAD1、RUNX2、MEK1、ERK2蛋白表达降低，OSX蛋白表达升高；下丘脑SMAD1、RUNX2、OSX、MEK1mRNA表达水平降低，OSX蛋白表达降低，BMP2、SMAD1、RUNX2、MEK1、ERK2蛋白表达升高，是绝经后骨质疏松症发病机制之一 3.补肾复方能明显提高绝经后骨质疏松症大鼠的骨密度。 4.补肾复方能明显提高绝经后骨质疏松症大鼠血清BGP含量，降低绝经后骨质疏松症大鼠血清TRACP含量，而起到防治绝经后骨质疏松症的作用 5.补肾复方能使绝经后骨质疏松症大鼠股骨BMP2、OSX、MEK1mRNA表达水平明显降低，SMAD1、RUNX2mRNA表达水平升高，BMP2、SMAD1、OSX、MEK1、ERK2蛋白表达升高；肾组织SMAD1、OSXmRNA表达水平降低，BMP2、RUNX2、MEK1、ERK2mRNA表达水平升高，RUNX2、MEK1、ERK2蛋白表达水平降低，SMAD1、OSX蛋白表达升高；下丘脑ERK2mRNA表达水平升高，BMP2、SMAD1、RUNX2、MEK1、ERK2蛋白表达降低，OSX蛋白表达升高；提示补肾复方可能通过改善和调控下丘脑、肾、股骨BMP2、SMAD1、RUNX2、OSX、MEK1、ERK2的mRNA、蛋白表达，起到防治绝经后骨质疏松症的作用