尼泊尔鸢尾异黄酮是葛花中的主要异黄酮成分之一,具有广泛的药理活性如抗炎、抗氧化、抑菌、抗肿瘤、雌激素样作用、保护酒精中毒引起的肝损伤等。实验室前期对野葛花(P. Pueraria flower)中主要的异黄酮成分葛花苷做了详细深入的研究,然而,其苷元尼泊尔鸢尾异黄酮的体内外代谢研究还未见报道。本研究中,利用UHPLC/Q-TOF MS方法研究了尼泊尔鸢尾异黄酮在大鼠体内外的代谢,具体的研究分为以下几个部分。
1.利用萃取、活性炭吸附、重结晶等方法从野葛花的乙醇提取物中分离得到尼泊尔鸢尾异黄酮单体,并用TLC、HPLC-UV、UHPLC/Q-TOF MS、H-NMR等方法对尼泊尔鸢尾异黄酮进行定性鉴别和纯度检测,结果发现,所得淡黄色结晶状粉末为尼泊尔鸢尾异黄酮,纯度大于95%,为后续尼泊尔鸢尾异黄酮在大鼠体内外代谢提供物质基础。
2.采用UHPLC/Q-TOF MS方法研究了尼泊尔鸢尾异黄酮在大鼠体内的代谢,口服灌胃给予正常大鼠100mg/kg的尼泊尔鸢尾异黄酮,按照时间点和时间段采集大鼠血浆、胆汁、尿液和粪便样品,分别利用沉淀蛋白、固相萃取(SPE)和超声提取的方法处理生物样品。利用实验室前期分离得到的标准品、化合物的极性和质谱裂解规律等方法,共检测并鉴定到尼泊尔鸢尾异黄酮在大鼠体内46个代谢物。尼泊尔鸢尾异黄酮在大鼠体内的代谢途径主要包括脱羰基、还原、去甲基、去甲氧基、去羟基化、羟基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等。同时,也给出了不同类型的代谢物在各自生物基质中的相对含量。原型是主要的排泄形式,在尿液和粪便中分别占28%和80%。作为多羟基异黄酮,尼泊尔鸢尾异黄酮在血浆中的含量仅为2%,而以Ⅱ相代谢物形式为主,尼泊尔鸢尾异黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷是尼泊尔鸢尾异黄酮在体内的主要形式,在血浆和胆汁中分别占65%和95%。
3.葛花苷和尼泊尔鸢尾异黄酮是葛花中的主要异黄酮成分,且都有广泛的药理活性。肠道菌群在异黄酮代谢中起重要作用,并且对于口服药物的活性起重要作用。目前为止葛花苷和尼泊尔鸢尾异黄酮体外代谢还没有深入的研究报道。本实验采用UHPLC/Q-TOFMS方法用以检测葛花苷和尼泊尔鸢尾异黄酮在人和大鼠肠道菌群厌氧培养之后的代谢轮廓图。菌群培养代谢物在厌氧条件下培养48h之后处理并检测。结果共检测到包括原型在内的17个代谢物,其中水解、去羟基化、去甲氧基、去甲基、羟基化、脱羰基和还原是葛花苷和尼泊尔鸢尾异黄酮在人和大鼠肠道菌群中检测到的代谢途径。尼泊尔鸢尾异黄酮在人和大鼠粪便中的转化率分别为8.57%和6.51%,鹰嘴豆芽素A (biochanin A, BiA)是尼泊尔鸢尾异黄酮相对主要的代谢物,其在人和大鼠菌群转化代谢物中分别为3.68%和4.25%。葛花苷在人和大鼠肠道菌群中的转化率分别为99.92%和98.54%,主要代谢物尼泊尔鸢尾异黄酮分别占人和大鼠肠道菌群总代谢物的89.58%和89.38%。此研究不仅给出了葛花苷和尼泊尔鸢尾异黄酮的代谢途径,还建立了一种简便、快速、灵敏、价格低廉的化合物肠道菌群生物转化代谢研究方法。
4.以大豆苷元为内标,采用UHPLC/Q-TOF MS方法研究大鼠口服给予尼泊尔鸢尾异黄酮100mg/kg后,大鼠血浆中原型及代谢物的药代动力学。采用乙腈沉淀蛋白法处理血浆样品,通过与标准品比对、洗脱顺序及质谱碎片,共检测到包括原型在内的14个代谢物。研究了3个主要葡萄糖醛酸化代谢物鸢尾黄素-7-O-葡萄糖醛酸苷(tectorigenin-7-O-glucuronide,Te-7G),鹰嘴豆素A-6-O-葡萄糖醛酸苷(6-hydroxybiochanin A-6-O-glucuronide,6-OH-BiA-6G),尼泊尔鸢尾异黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷(irisolidone-7-O-glucuronide, Ir.7G),3个硫酸化代谢物鸢尾黄素-7-O-葡萄糖醛酸-4'-O-硫酸酯(Tectorigenin-7-O-glucuronide-4'-O-sulfate,Te-7S-4'S),鸢尾黄素-7-O-硫酸酯(tectorigenin-7-O-sulfate,Te-7S)和尼泊尔鸢尾异黄酮-7-O-硫酸酯(irisolidone-7-O-sulfate,Ir-7S),以及苷元鸢尾黄素(tectorigenin,Te)和原型尼泊尔鸢尾异黄酮(irisolidone,Ir)的药代动力学参数。结果发现,Te-7S-4'S,Te-7G,Te-7S,6-OH.BiA-6G,Ir-7G,Te,Ir-7S,Ir的Cmax和Tmax分别为0.297mol/L,10.3h,0.199mol/L,21.67h,0.154mol/L,8.00h,4.10mol/L,15.3h,10.7mol/L,9.71h,O.918mol/L,11.3h,0.150mol/L,8.67h,0.843mol/L,9.67h。Ir-7G和6-OH-BiA-6G是大鼠口服尼泊尔鸢尾异黄酮后血浆中的主要代谢物,分别占总代谢物的55.8%和31.5%,与之前的研究大鼠口服葛花苷的代谢类似；葛花苷代谢物的Tmax在34～38h,远远大于尼泊尔鸢尾异黄酮的达峰时间(均小于21h),说明苷元在大鼠体内吸收更快。比较了血浆中主要代谢物Ir-7G与Te,Ir和葛花苷的体外醛糖还原酶抑制活性,表明活性Te>Ir,Ir-7G,葛花苷,提示粉葛花治疗糖尿病的作用应强于野葛花。
本课题通过对尼泊尔鸢尾异黄酮在大鼠体内的代谢、体外菌群转化及大鼠血浆中药代动力学研究,系统揭示了大鼠口服尼泊尔鸢尾异黄酮后,其在体内的吸收、代谢和排泄过程,为葛花异黄酮类化合物构效关系研究,活性新药研发等提供依据,也为中药成分的体内外代谢研究提供方法学借鉴。
