油樟叶提取物的抗菌、镇痛和抗炎活性及其作用机理研究

油樟[Cinnamomum longepaniculatum (Gamble) N. Chao]是樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物,是中国特有树种,为国家Ⅱ级重点保护野生植物,主要产在四川宜宾,在湖北、湖南、陕西、云南、江西、广西、广东等地均有分布。油樟含有丰富的芳香油,是香料、医药、日用及化工产品的重要原料来源。油樟叶含油率高达3.8-4.5%,其中1,8-桉叶油素为油樟叶挥发油的主要成份,含量为58.55%,比广东、江西等省高2.6倍。为了充分利用油樟资源,本研究探讨了油樟叶各提取物对动物常见细菌和真菌的体外抑菌活性,并研究其抑菌机理。同时,还观察油樟叶提取物对疼痛和炎症动物模型的镇痛和抗炎作用,以及对炎症渗出液中前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、组胺(Histamine, Hist)和5一羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)含量的影响。主要研究结果如下： 1.油樟叶提取物的制备：采用系统溶剂法制备油樟叶提取物,即先将油樟叶用水蒸气蒸馏提取挥发油,挥发油通过精馏方式分离得到两种单体物质：1,8-桉叶油素和黄樟油素。再将提取挥发油后的油樟叶残渣用95%乙醇连续回流提取,最后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇逐级萃取。通过以上提取工艺后,依次得到油樟叶挥发油、1,8-桉叶油素、黄樟油素、油樟叶乙醇提取物、油樟叶乙醇提取物石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水萃取相共8种油樟叶提取物。 2.油樟叶提取物对三种常见致病细菌的体外抗菌活性研究：研究了油樟叶挥发油、1,8-桉叶油素、黄樟油素、油樟叶乙醇浸膏和乙醇浸膏的石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水萃取相对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimal bacteriocidal concentration, MBC),并绘制其随油樟叶提取物浓度和作用时间变化的抑菌曲线,同时透射电镜观察油樟叶挥发油在MIC值浓度下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌超微结构的影响。结果表明,油樟叶挥发油、1,8-桉叶油素、黄樟油素、乙醇浸膏、石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相、水萃取相对三株细菌的MIC值和MBC值分别为：大肠杆菌：3.13ul/ml和3.13ul/ml,6.25ul/ml和6.25ul/ml,12.5ul/ml和12.5ul/ml,31.25mg/ml和62.5mg/ml,>500mg/ml和>500mg/ml,15.63mg/ml和31.13mg/ml,7.81mg/ml和15.63mg/ml,31.25mg/ml和62.5mg/ml;沙门氏菌6.25ul/ml和6.25ul/ml,6.25ul/ml和6.25ul/ml,6.25ul/ml和12.5ul/ml,31.25mg/ml和62.5mg/ml,31.25mg/ml和125mg/ml, 3.90mg/ml和7.81mg/ml,15.63mg/ml和31.25mg/ml,31.25mg/ml和62.5mg/ml金葡球菌：6.25ul/ml和6.25ul/ml,6.25ul/ml和12.5ul/ml,12.5ul/ml和12.5ul/ml,31.25mg/ml和62.5mg/ml,7.81mg/ml和15.63mg/ml,7.81mg/m和15.63mg/ml,15.63mg/ml和31.13mg/ml,31.25mg/ml和62.5mg/ml。抑菌曲线结果显示,油樟叶挥发油、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相对三种细菌的作用均属于浓度依赖型。电镜下：对照组大肠杆菌和金黄色葡萄球菌形态正常；试验组,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在油樟叶挥发油MIC值浓度作用4h后,其细胞器破坏,部分细胞呈空泡状。上述结果表明：油樟叶提取物对三种细菌均具有一定的抗菌活性,其活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和油樟叶挥发油三个部分,其中油樟叶挥发油的抗菌活性最强,其抑菌机理主要为引起细菌细胞膜及细胞器的损伤。 3.油樟叶提取物体对三株常见皮肤癣菌的体外抗菌活性研究：研究了油樟叶挥发油、1,8-桉叶油素、黄樟油素、油樟叶乙醇浸膏、乙醇浸膏的石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水萃取相对须毛癣菌、犬小孢子菌、石膏小孢子菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory fungal concentration, MIC)和最低杀菌浓度MFC(minimal fungicidal concentration, MFC);并绘制体外杀菌曲线,观察MIC浓度下油樟叶挥发油对三株真菌的动态杀菌过程；透射电镜下观察油樟叶挥发油在MIC值浓度下对三株真菌超微结构的影响。结果显示,油樟叶挥发油、1,8-桉叶油素、黄樟油素、乙醇浸膏、石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水萃取相对三株真菌的MIC值和MFC值分别为,须毛癣菌:3.13ul/ml和3.13ul/ml,25ul/ml和50ul/ml,6.25ul/ml和12.5ul/ml, 12.5mg/ml和25mg/ml,>50mg/ml和>50mg/ml,3.13mg/ml和3.13mg/ml,6.25mg/ml和25mg/ml,12.5mg/ml和>50mg/ml;犬小孢子：3.13ul/ml和3.13ul/ml,12.5ul/ml和25ul/ml,6.25ul/ml和12.5ul/ml,12.5mg/ml和25mg/ml,>50mg/ml和>50mg/ml, 3.13mg/ml和12.5mg/ml,25mg/ml和50mg/ml,>50mg/ml和>50mg/ml;石膏小孢子：3.13ul/ml和3.13ul/ml,25ul/ml和50ul/ml,6.25ul/ml和12.5ul/ml,25mg/ml和50mg/ml, >50mg/ml和>50mg/ml,6.25mg/ml和12.5mg/mL,6.25mg/ml和25mg/ml,>50mg/ml和>50mg/ml。杀菌曲线结果表明,作用的前12小时内油樟叶挥发油对三株真菌的杀菌作用最强,随后杀菌作用降低；电镜下：对照组的三株真菌形态正常,在MIC值浓度下,三株真菌原有的细胞器模糊不清、溶解或消失。上述结果表明：除了石油醚萃取相和水相外,其他油樟叶提取物均对三株真菌均具有一定的抗菌活性,其活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取相和油樟叶挥发油两个部分,其中抑菌活性最强的为油樟叶挥发油部分,其抑菌机理为破坏真菌的细胞膜和细胞器。 4.油樟叶提取物的镇痛活性研究：依据抑菌活性研究结果,选择油樟叶乙醇提取物、乙酸乙酯萃取相以及油樟叶挥发油进行镇痛活性的研究。分别采用热板法镇痛实验和醋酸扭体镇痛实验观察其镇痛活性。结果表明：乙醇提取物和乙酸乙酯萃取相均能显著减少醋酸所致小鼠扭体次数,但都不能显著提高小鼠热板痛阂值。油樟叶挥发油对热致痛小鼠可延长其痛阈时间,高剂量组较为明显；对醋酸致痛小鼠,各剂量组均可减少其扭体次数,与溶剂对照组比较其作用有显著性差异。由此可见,油樟叶乙醇提取物、乙酸乙酯萃取相以及油樟叶挥发油均具有一定的镇痛作用。 5.油樟叶提取物体的抗炎活性研究：依据抑菌活性研究结果,选择油樟叶乙醇提取物、乙酸乙酯萃取相以及油樟叶挥发油对急性炎症模型的抗炎效果及其抗炎机理进行研究。采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、小鼠腹腔毛细血管通透性亢进、角叉菜胶致大鼠足肿胀模型观察油樟叶提取物的抗炎作用并测定炎性渗出液中的PGE2(前列腺素E2)、组胺及5-HT含量,并做足趾肿胀的病理切片。结果表明,油樟叶乙醇浸膏、油樟叶乙醇浸膏乙酸乙酯萃取相以及油樟叶挥发油高、中、低剂量组对二甲苯致小鼠耳片肿胀、毛细血管通透性亢进和角叉菜胶有不同程度抑制作用,并能显著降低炎性渗出液中的PGE2、His及5-HT水平,具有改善组织水肿和减轻炎细胞浸润的活性,高剂量组与溶剂对照组相比有显著性差异(P<0.01)。上述结果表明：油樟叶乙醇浸膏、油樟叶乙醇浸膏乙酸乙酯萃取相和油樟叶挥发油对急性炎症具有一定的抑制活性。其抗炎机理为降低炎性渗出液中的PGE2、His及5-HT水平,具有改善组织水肿和减轻炎细胞浸润的作用。