梓醇对永久性脑缺血大鼠保护作用及药动学研究

目的: 观察梓醇对永久性局灶性脑缺血大鼠功能恢复的影响。观察梓醇不同给药剂量对模型大鼠神经行为学评分、脑组织形态学变化的影响。建立大鼠血清中梓醇的高效液相色谱测定方法,研究梓醇在大鼠体内的药代动力学。 方法: 1.梓醇对永久性脑缺血大鼠保护作用的研究 采用凝闭法制备大鼠右侧永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)模型。经模型鉴定后,取造模成功的大鼠分为梓醇低、中、高(1mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg)剂量组,胞磷胆碱(0.5g/kg)治疗对照组,溶媒对照组(给予等容积的生理盐水),模型组(不给药),共6组。另设假手术组。本实验设计共计7组,每组各9只大鼠。取各组中的6只,于造模手术后6h开始,每天腹腔注射给药1次,连续给药7d。于给药第1、4、7d对各实验组进行神经行为学评分,包括Bederson神经功能评分,肌力评定,平衡木行走试验。按实验设计给药结束后,腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉大鼠,经心脏行4%多聚甲醛灌注固定,迅速取脑,切取大脑视神经交叉前后厚约2mm脑组织块(含大鼠感觉运动皮质)于4%多聚甲醛溶液中4℃固定4h,制备脑组织切片,行HE染色及尼氏染色,镜下观察脑组织病理改变。取各组中其余3只,于造模手术后6h开始,每天腹腔注射给药1次,连续给药3d,于第3d腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉大鼠,快速断头取脑,TTC染色,测定脑缺血梗死体积。 2.梓醇在大鼠体内的药代动力学研究 色谱条件及方法专属性研究:色谱柱为Hypersil C-18 (250mm×4.0mm,5μm);预柱为C-18 (10mm×4.6mm,5μm);流动相为水-乙腈(99.5:0.5,V/V);流速为l.0ml/min;进样量为20μl;柱温为40℃;检测波长为210 nm。在该色谱条件下进行标准曲线、绝对回收率、方法回收率、精密度、含药血清冻存稳定性研究。 药代动力学实验方法研究:健康SD大鼠15只,随机分为低、中、高三个剂量组,每组5只。分别尾静脉注射3.5mg/kg、7.0mg/kg、14.0mg/kg三种不同剂量的梓醇。给药后分别于1min、5min、15min、30min、45min、90min、120min、240min、420min、600min从大鼠眼眶静脉丛采血0.5ml,测定梓醇的血药浓度。将所获得的数据整理,用中国药理学会数学药理专业委员会编制的3P87实用药代动力学计算程序分析计算,得到梓醇在大鼠体内的药代动力学参数。 结果: 1.梓醇对永久性脑缺血大鼠的保护作用 梓醇对脑缺血大鼠神经行为的影响:给药第7d,Bederson神经功能评分结果,梓醇各剂量组和胞磷胆碱组均比模型组和生理盐水组恢复更好,差异具有显著性(P<0.05);各实验组肌力评定结果,梓醇各剂量组和胞磷胆碱组肌力改善显著,与模型组和生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05);各实验组平衡木行走试验发现,各组(假手术组除外)大鼠平衡功能均有所改善,但各组间差异无显著性意义(P>0.05)。 病理组织学观察:脑组织切片HE染色观察发现,术后第7天,各治疗组组织病理改变较模型组均有不同程度的减轻,神经细胞肿胀、空泡样改变等病变程度较轻;尼氏染色见各治疗组缺血周边大脑皮质神经元丢失较模型组明显减轻,残存神经元呈现极性排列,而模型对照组排列紊乱。 脑缺血梗死体积的变化:脑组织TTC染色观察缺血梗死区的体积发现,模型组脑组织梗死面积较大。而梓醇各治疗组脑梗死体积较模型组明显缩小,与模型组相比有显著性差异(P<0.01)。生理盐水组与模型组无显著差异(P>0.05)。梓醇高剂量组脑梗死体积较中、低剂量组缩小,但无显著性差异(P>0.05)。 2.梓醇在大鼠体内的药代动力学研究结果 大鼠血清中梓醇含量测定方法的建立:在前述色谱条件下,梓醇的峰形良好,无杂质峰的干扰,血清样品中梓醇的理论塔板数大于9000,保留时间约为10.3min。梓醇在0.50～70.1μg/ml浓度范围内线性关系良好。线形回归方程为:y=6996.6x-826.89(r=0.9992,n=5)。三浓度含药血清平均绝对回收率为86.04%～90.00%(n=5),平均方法回收率为100.56%～99.00%(n=5),日内RSD为5.76%～3.45%(n=5),日间RSD为4.02%～6.86%(n=5)。 梓醇在大鼠体内的药代动力学参数:大鼠静脉注射低、中、高浓度梓醇后,动力学行为符合二房室模型的特点。主要药代动力学参数如下:血清消除半衰期(T1/2β)分别为:165.46±12.35min、0.21±0.01min、185.74±13.69min ;中央室表观分布容积( Vc )为:0.19±0.03(mg/kg)/(μg/ml)、0.21±0.01(mg/kg)/(μg/ml)、0.25±0.01(mg/kg)/(μg/ml) ;清除率( Cl )分别为:0.0014±0.0001mg/kg/min/(ug/ml)、0.0016±0.0001mg/kg/min/(ug/ml)、0.0018±0.0002mg/kg/min/(ug/ml) ;曲线下面积( AUC )分别为:2450.50±169.22(mg/ml)·min、4347.94±399.45(mg/ml)·min、7918.80±793.61(mg/ml)·min。 结论: 1.本研究证实,梓醇可促进永久性局灶性脑缺血大鼠神经功能恢复,对恢复脑缺血大鼠瘫痪肢体肌力也有促进作用。梓醇可减少脑缺血大鼠脑梗死体积,减轻缺血周边大脑皮质神经元丢失以及脑组织缺血性病理改变,具有一定的缺血脑保护效果。 2.本研究采用反相高效液相色谱法测定血清中梓醇的浓度,该法线形良好,操作简便,精密度及重现性均良好。梓醇静脉注射,其药代动力学符合二房室模型,所得参数反映了梓醇在体内的消除规律,可为临床研究提供参考和指导。