支气管哮喘（哮喘）是由多种炎症细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等）、气道结构细胞（气道上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞）以及多种细胞因子共同参与的气道慢性炎症性疾病。哮喘发病机制复杂，至今尚未完全阐明。气道慢性炎症是哮喘的本质，研究哮喘气道炎症发生、发展机制对于哮喘防治具有重要临床指导意义。随着对哮喘气道炎症的深入研究，人们对哮喘的认识已不再局限于嗜酸性粒细胞气道炎症，而更强调哮喘是多种细胞共同参与的气道慢性炎症。目前研究显示哮喘的气道炎症存在不同的亚型，可分为嗜酸细胞性哮喘（eosinophilicasthma，EA）和非嗜酸细胞性哮喘（non-eosinophilic asthma，NEA），其中半数以上的非嗜酸细胞性哮喘为中性粒细胞性哮喘（neutrophilic asthma，NA）。但哮喘气道中性粒细胞增多的机制目前尚未完全阐明。辅助性T淋巴细胞(T helper cell，Th细胞)在哮喘气道慢性炎症中发挥着重要的免疫调节作用。Th2细胞占优势的Th1/Th2细胞失衡被认为是变应性哮喘气道嗜酸细胞性炎症形成及发展的免疫学基础。但有研究发现非变应性哮喘患者存在不依赖于Th2细胞免疫学机制介导的气道中性粒细胞炎症。近年来发现Th17细胞及其效应因子IL-17在支气管哮喘等变态反应性疾病中发挥重要作用， IL-17具有强大的募集、活化中性粒细胞的作用，可能是导致气道中性粒细胞增多的机制之一。但Th17细胞在不同气道炎症类型哮喘发病中的作用是否相同，在中性粒细胞性哮喘发病机制中是否存在Th17细胞分化优势，鲜有报道。我们前期动物实验通过建立中性粒细胞哮喘小鼠模型进行研究，结果显示中性粒细胞哮喘小鼠存在强烈的Th17细胞免疫、中度Th2细胞免疫反应，Th17细胞通过IL-17介导哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的发生，并通过上调转录因子RORγt促进Th17细胞分化，中性粒细胞哮喘小鼠体内已分化的Th17细胞在机体高IL-7环境下，依赖JAK/STAT5信号途径激活维持其存活状态。但在人类中性粒细胞性哮喘发病机制中是否存在同样的Th17细胞分化优势是本课题所要研究的第一个问题。
糖皮质激素作为治疗哮喘最有效的抗炎药物主要通过减少T淋巴细胞活化及抑制细胞因子的产生减轻气道炎症反应。对于多数哮喘患者以吸入糖皮质激素（ICS）为基础的规范化哮喘治疗可达到哮喘控制，但仍有部分患者并没有取得预期的效果，少数患者症状持续存在、甚至恶化，随着对哮喘气道炎症的深入研究，发现激素治疗效果欠佳的哮喘患者多为中性粒细胞哮喘。近年有研究发现，糖皮质激素不能抑制Th17细胞及其效应因子IL-17介导的气道中性粒细胞炎症，但亦有研究显示糖皮质激素治疗可下调IL-17表达，我们前期动物实验研究亦发现地塞米松可通过下调中性粒细胞哮喘小鼠Th17细胞特异性转录因子RORγt表达水平，降低Th17细胞数量及其相关细胞因子IL-17水平，部分减轻哮喘小鼠气道中性粒细胞炎症。但地塞米松对Th17细胞存活延长的状态及气道中性粒细胞凋亡率无明显影响。目前，对于糖皮质激素在Th17细胞介导的哮喘气道炎症中的作用存在不同的研究结果。我们将在探讨Th17细胞与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症相关性的基础之上，进一步探讨糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的作用。本研究将初步阐明Th17细胞在儿童中性粒细胞性哮喘发病中的作用，为儿童中性粒细胞性哮喘的治疗寻求新线索及提供理论依据，有助于哮喘的个体化治疗。研究分为两部分进行：
第一部分Th17细胞及相关细胞因子与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症相关性分析
目的探讨Th17细胞及相关细胞因子与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的相关性。
方法随机选取28例未应用糖皮质激素治疗急性发作期哮喘患儿，进行肺功能测定、诱导痰细胞分类计数，并根据诱导痰液细胞学分类分成三组：嗜酸细胞性哮喘（EA组）12例；中性粒细胞哮喘（NA组）10例；非嗜酸细胞非中性粒细胞性哮喘（NEA+NNA组）共6例，并选取健康对照组(HC组)10例，采用流式细胞术检测外周血Th17、Th2细胞及Th17细胞上Ki-67、STAT5、BCL-2的表达；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测外周血单个核细胞RORγt-mRNA的表达；ELISA方法检测痰上清液、血浆、经PMA刺激的PBMC培养上清液IL-17浓度、痰上清液IL-8、IL-5浓度，并进行相关性分析。
结果1、NA组外周血Th细胞中Th17细胞百分比较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞百分比较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞百分比比较差异无统计学意义(p>0.05)；EA组外周血Th细胞中Th2细胞百分比较NA组、NEA+NNA组、HC组均增高(p<0.01)，NA组、NEA+NNA组Th2细胞百分比较HC组增高(p <0.01)，NA组与NEA+NNA组间Th2细胞百分比比较差异无统计学意义(p>0.05)；2、NA组外周血Th17细胞Ki-67表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞Ki-67表达阳性率较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞Ki-67表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组外周血Th17细胞STAT5表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞STAT5表达阳性率较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞STAT5表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组外周血Th17细胞BCL-2表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组与HC组间Th17细胞BCL-2表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；3、NA组外周血单个核细胞RORγt-mRNA表达较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组RORγt-mRNA表达较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间RORγt-mRNA表达比较差异无统计学意义(p>0.05)；4、NA组痰上清液IL-17浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组痰上清液IL-17浓度较HC组增高(p <0.01)，EA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；EA组痰上清液IL-5浓度较NA组、NEA+NNA组、HC组均增高(p <0.01)，NA组、NEA+NNA组痰上清液IL-5浓度较HC组增高(p <0.01)，NA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-5浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组痰上清液IL-8浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p <0.01)，EA组、NEA+NNA组痰上清液IL-8浓度较HC组增高(p <0.01)，EA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-8浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；5、NA组、EA组、NEA+NNA组与HC组间血浆IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)，但经PMA刺激培养后，NA组PBMC培养上清液IL-17浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组PBMC培养上清液IL-17浓度较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间PBMC培养上清液IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；同时，经PMA刺激培养后，NA组、EA组、NEA+NNA组PBMC培养上清液IL-17浓度较血浆IL-17浓度均明显增高(p均<0.01)，HC组PBMC培养上清液IL-17浓度与血浆IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)。6、哮喘患儿诱导痰NEU百分比与外周血Th细胞中Th17细胞比例及痰上清IL-17、IL-8、PBMC培养上清液IL-17浓度呈明显正相关；哮喘患儿诱导痰NEU百分比与FEV1%pred、PEF%pred呈明显负相关；哮喘患儿诱导痰EOS百分比与外周血Th细胞中Th2细胞比例及痰上清IL-5浓度呈明显正相关。
结论1、Th17细胞和Th2细胞均不同程度共同参与儿童哮喘的发病。儿童中性粒细胞性哮喘外周血Th17细胞、特异性转录因子RORγt表达及痰液IL-17水平均明显高于嗜酸细胞性哮喘及非嗜酸细胞非中性粒细胞性哮喘，并且与诱导痰中性粒细胞比例呈正相关。提示Th17细胞可能通过IL-17介导中性粒细胞性哮喘气道炎症的发生。2、儿童中性粒细胞性哮喘体内已分化的Th17细胞存活延长，可能与JAK/STAT5信号途径激活有关。
第二部分吸入糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的影响
目的探讨吸入糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的影响
方法第一部分研究对象中的中性粒细胞性哮喘患儿(NA组)10例，在医师指导下规则吸入糖皮质激素治疗3个月后，进行肺功能测定、诱导痰细胞分类计数；采用流式细胞术检测外周血Th17细胞及Th17细胞上Ki-67、的表达；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测外周血单个核细胞RORγt-mRNA的表达；ELISA方法检测痰上清液、PBMC培养上清液IL-17浓度。
结果1、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后FEV1%pred、PEF%pred均较治疗前明显增高(均p <0.01)，但仍低于健康对照组（P均<0.05）；2、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后诱导痰NEU百分比较治疗前明显降低(p<0.01)，但仍高于健康对照组（P<0.05）；3、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后外周血Th17细胞及Th17细胞Ki-67表达均较治疗前明显降低(均p<0.01)，但仍高于健康对照组（均P<0.01）；4、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后外周血单个核细胞RORγt-mRNA表达较治疗前明显降低(p<0.01)，与健康对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)；5、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后痰上清液及PBMC培养上清液IL-17浓度均较治疗前降低(分别为：p<0.05，p <0.01)，但仍高于健康对照组（均P <0.01）。
结论吸入糖皮质激素可通过下调特异性转录因子RORγt的表达水平，在一定程度上降低外周血Th17细胞及痰液IL-17水平，减轻Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症。
