广谱抗菌活性LactobacillusacidophilusNX2-6的分离筛选及其抗菌物质的研究

随着人民生活水平的提高和食品安全意识的增强,人们对食品的安全卫生和自身健康状况日益关注,天然食品和绿色食品更容易被消费者认可和接受,因此研究开发广谱、高效、稳定、安全的天然抗菌物质已成为当今国际食品防腐剂发展的主要方向。其中微生物来源的天然防腐剂,由于生产成本低廉、来源广泛等原因,目前已成为研究热点。酸马奶是集营养和保健于一体的蒙古族的传统乳制品,从中筛选产抗菌物质的乳酸菌,既安全、新颖又有挖掘潜力。为此,本文以内蒙古锡林浩特地区牧民的传统发酵酸马奶为菌种来源,对其进行乳酸菌的分离鉴定,并在其中筛选出具有广谱抗菌活性的菌株,并利用HPLC、ESI-MS/CID及MALDI-TOF/TOF-MS等分析技术对抗菌物质进行结构鉴定,同时对抗菌物质的理化性质,抗菌物质对大肠杆菌的作用机理进行了研究。为开发新型微生物源天然防腐剂提供理论基础。具体研究结果如下： 1.从内蒙古锡林浩特地区的6份酸马奶样品中分离到82株乳酸菌,以Lactobacillus acidophilus ATCC 4356、Lactobacilus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002、Lactococcus lactis subsp. lactis IFO 12007以及Enterococcus faecalis IFO3427等4株标准菌株作为对照菌株,对其进行生物学特性研究,其鉴定结果为：38株乳杆菌分别为14株嗜酸乳杆菌、11株干酪乳杆菌、7株植物乳杆菌、2株弯曲乳杆菌及4株詹氏乳杆菌；44株乳球菌分别为10株粪肠球菌、22株乳酸乳球菌乳酸亚种、3株肠膜明串珠菌葡聚糖亚种及9株嗜热链球菌。 2.内蒙古锡林浩特地区酸马奶乳酸菌中的乳杆菌主要以嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌为主,分别占总分离株的17.1%和13.4%；乳球菌主要以乳酸乳球菌乳酸亚种、粪肠球菌及嗜热链球菌为主,分别占总分离株的26.8%、12.2%及11.0%。乳杆菌和乳球菌比例相差不大,这可能与取样区域、时机和分离条件(如温度、酸度)可直接影响着乳酸菌的分离率和分离乳酸菌的种类。 3.82株乳酸茵中31株茵显示了抗菌活性,占总菌数的37.8%；其中27株菌对大肠杆菌和蜡状芽孢杆菌都有抗菌活性,占总菌数的32.9%。在这27株茵中乳杆菌和乳球菌各有15和12株,分别占乳杆菌和乳球菌总数的39.5%和27.3%。根据其抗菌活性复筛结果得知,嗜酸乳杆菌NX2-6对大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌和米曲霉均显示了较强的抗菌活性,因此将菌株NX2-6确定为研究抗菌物质的供试菌株。对其进行形态特征观察并通过16S rDNA基因序列测定,获得16S rDNA序列长度为1480 bp,此序列已在GenBank数据库中登录,登录号是EU878007。 4.嗜酸乳杆菌NX2-6产生的抗菌物质具有热稳定性,在pH值2.0-5.0范围内具有抗菌活性,细菌素的活性随pH值得上升而逐步降低,pH 6.0时失去抗菌活性。对胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K敏感,但对α-胰凝乳蛋白酶不敏感。虽然用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后抑菌圈直径显著缩小,但仍具有很强的抑菌作用,并且抗菌物质对紫外线照射具有较好的稳定性,因此表明该抗菌物质为蛋白类物质或者非单一的抗菌物质。抗菌物质对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均显示了抗菌活性,是一种广谱抗菌活性物质。 5.对嗜酸乳杆菌NX2-6产生的抗菌物质进行分子结构鉴定研究。结果表明,其分子量集中于50 Kda以下。抗菌物质的最大紫外光谱吸收峰在219.00 nm处。将抗菌物质经高效液相色谱(HPLC)分离纯化获得具有抗菌活性的组分1和组分2的纯物质。对这两个组分进行ESI-MS/CID和MALDI-TOF/TOF-MS分析得知,组分1中的抗菌活性物质是分子量为118.05的琥珀酸。对组分2进行MALDI-TOF／TOF-MS分析结果表明,组分2是分子量为825.149的肽类物质,由7个氨基酸组成,排列顺序为Asn-Thr-Arg-Tyr-Lys-Ser-Gly,是一个新型抗菌肽,命名为acidocin NX2-6. 6.为了提高嗜酸乳杆菌NX2-6产生抗菌物质的得率,采用Plackett-Burman试验设计对培养基的10种成分和培养温度、培养时间、起始pH及接种量等14个相关因素进行筛选,发现在PB设计的二水平范围内,葡萄糖、乙酸钠和培养时间与抗菌物质得率显著正相关(p<0.05),柠檬酸三钠水合物对抗菌物质得率产生显著的负效应(p<0.05),其它相关因素没有显著效应(p>0.05)。 7.通过响应曲面法对嗜酸乳杆菌NX2-6产生抗菌物质具有显著影响的4个因素：葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸三钠水合物以及培养时间的最佳组合水平建立了二次多项数学模型。对该模型方程求解得出,在各因素分别为：葡萄糖浓度60.0 g／L、乙酸钠浓度8.0 g／L、柠檬酸三钠水合物浓度5.0g／L及培养时间36 h时,可获得最大的抑菌圈直径,预测值为21.37 mm。此预测值被5组验证实验所证实,相关系数R2为0.9918。 8.嗜酸乳杆菌NX2-6产生抗菌物质的最佳发酵条件确定为：蛋白胨20.0g／L、牛肉浸膏20.0g／L、酵母浸出粉10.0 g／L、葡萄糖60.0g／L、吐温-80 3.0 g／L、K2HPO4·3H2O 4.0 g／L、乙酸钠8.0 g／L、MgSO4·7H2O 400.0 mg／L,、MnSO4·H2O 76.0mg／L、柠檬酸三钠水合物6.0 g／L、起始pH 6.0、培养温度40℃、接种量2%(V／V)及培养时间36 h。在优化的发酵条件下,嗜酸乳杆菌NX2-6发酵液抗菌活性增加约80.0%。 9.嗜酸乳杆菌NX2-6所产的抗菌物质对大肠杆菌的最小抑菌浓度为895.8μg／mL。该抗菌物质对繁殖期和非繁殖期大肠杆菌细胞具有较高的抑菌活性,其主要作用于大肠杆菌细胞膜,然后进一步溶解菌体而起到杀菌作用。