莳萝子挥发油抗真菌活性及其作用机制研究

随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂等广泛的应用,念珠菌和皮肤癣菌等真菌引起的真菌感染日益增加,临床真菌感染的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前,临床常用抗真菌药物主要是唑类药物和两性霉素B,这些抗真菌药物均对人体有不同程度的毒副作用；且随着抗真菌药物的广泛应用,临床上出现越来越严重的真菌耐药现象。因此,临床上迫切需要寻找一种新的抗真菌药物来治疗真菌感染。 挥发油是植物体内次生代谢产物之一。据报道,挥发油具有抗菌驱虫、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、解热镇痛、祛痰止咳等多种生物活性。莳萝子是伞形科草本植物莳萝的种子,具有香气。其挥发油具有降血脂、抗氧化、抗菌等多种生物活性。 本研究是以莳萝子挥发油为研究对象,研究其体外体内抗菌活性和抗菌机制。 1.采用水蒸气蒸馏法,提取莳萝子挥发油。并研究莳萝子存储时间对挥发油得率和抗菌活性的影响。实验结果表明,随着储存时间的延长,莳萝子挥发油得率有所降低,储存一年后,莳萝子挥发油得率降低了39.02%。采用GC-MS对莳萝子挥发油进行分析,从莳萝子挥发油中共鉴定出23个化合物,占总含量的99.4%。主要物质有香芹酮(41.5%),柠檬烯(32.6%)及芹菜脑(16.8%)等。采用高效气相色谱法,依据香芹酮和柠檬烯标准曲线测定了不同储存时间莳萝子的挥发油中香芹酮和柠檬烯的含量,分析和评价储存时间对莳萝子挥发油主要成分(香芹酮和柠檬烯)含量的影响。结果表明,储存时间对莳萝子挥发油主成分(香芹酮和柠檬烯)的含量基本上没有影响。 2.采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的真菌敏感性测定方案(M38-A2)采用微量稀释法测定莳萝子挥发油对皮肤癣菌的最低抑菌浓度(MIC),用带毒平板法测定莳萝子挥发油对皮肤癣菌菌丝抑制作用。研究莳萝子挥发油对皮肤癣菌孢子萌发和生物量的影响。进一步以红色毛癣菌为代表菌株,研究莳萝子挥发油对皮肤癣菌细胞膜中麦角固醇含量、线粒体中苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、三磷酸腺苷酶活性的影响。结果表明莳萝子挥发油抑制皮肤癣菌MIC为0.156-0.312μL/mL。当莳萝子挥发油浓度为1.25μL/mL时能完全抑制皮肤癣菌菌丝生长。不同浓度莳萝子挥发油对皮肤癣菌孢子萌发和生物量都有抑制作用,与浓度呈正相关。莳萝子挥发油处理红色毛癣菌后能减少细胞膜中麦角固醇的合成,降低线粒体中苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、三磷酸腺苷酶活性,表明莳萝子挥发油通过破坏细胞膜和线粒体达到抗菌效果。 3.采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的真菌敏感性测定方案(M27-A3)采用微量稀释法测定莳萝子挥发油对念珠菌(Candida spp.)的最低抑菌浓度(MIC)；在液体培养基中,观察不同浓度莳萝子挥发油对Candida spp生长曲线的影响以及Candida spp经莳萝子挥发油处理后的芽管萌发情况。由实验结果可知莳萝子挥发油对Candida spp具有较强抑制作用,MIC为0.312-0.625μL/mL；莳萝子挥发油在浓度为1.25-2.5μL/mL范围内能完全抑制Candida spp生长；由芽管萌发实验可知,莳萝子挥发油浓度为0.625μL/mL时,白色念珠菌(C.albicans09-1522)、克柔念珠菌(C. krusei09-1681)、热带念珠菌(C. tropicalis032)、近平滑念珠菌(C.parpapsilosis07-305)芽管形成率分别为3.33%、2.33%、1.67%、1.33%,说明莳萝子挥发油能抑制Candida spp芽管萌发。进一步用XTT法测定莳萝子挥发油对Candida spp生物膜形成的抑制作用,结果表明当莳萝子挥发油浓度大于0.312μL/mL能抑制(Candida spp生物膜的形成。用XTT法检测莳萝子挥发油对Candidaspp.成熟生物膜的活性的影响,结果表明,莳萝子挥发油能降低Candida spp生物膜的活性。比较莳萝子挥发油对Candida spp生物膜和悬浮细胞的抑制作用,结果表明挥发油抑制悬浮细胞作用强于生物膜。 4.采用小鼠免疫抑制模型进行体内实验,评价莳萝子挥发油对阴道念珠菌病的预防和治疗作用。结果表明莳萝子挥发油浓度为2%(v／v)能清除小鼠阴道C.albicans,真菌检验和组织病理检查证明了莳萝子挥发油对阴道念珠菌病有较强的防治作用。 5.以细胞膜和线粒体为靶标点研究莳萝子挥发油对C.albicans的抗菌机制,采用碘化吡啶染色法测定莳萝子挥发油对C.albicans细胞膜的损坏,结果表明莳萝子挥发油能严重破坏C.albicans的细胞膜。本实验进一步测定莳萝子挥发油对C.albicans线粒体功能的影响。采用罗丹明染色法测定莳萝子挥发油作用后C.albicans的线粒体膜电势、分光光度法测定线粒体脱氢酶活性、染色法测定线粒体内活性氧含量。结果表明莳萝子挥发油导致C.albicans线粒体膜电势超级化和线粒体内脱氢酶的活性被显著抑制。莳萝子挥发油所致线粒体功能的异常导致线粒体内活性氧累积,抗氧化剂半胱氨酸不但可以抑制莳萝子挥发油诱导的线粒体内活性氧累积,而且可以抑制莳萝子挥发油的抗真菌活性,说明活性氧是莳萝子挥发油发挥抗真菌作用的关键介质。 6.活性氧是真菌凋亡的关键调节因子,因此,本实验进一步研究莳萝子挥发油诱导C.albicans线粒体活性氧累积是否导致真菌凋亡。采用透射电镜观察莳萝子挥发油作用于C.albicans后细胞超微结构的改变,采用共聚焦显微镜观察DAPI染色后细胞核的形态变化,FITC-AnnexinV染色后C.albicans磷脂酰丝氨酸的外翻、FITC-VAD-FMK荧光染色法测定莳萝子挥发油作用后白色念珠菌(C.albicans)的Metacaspase活性,分光光度法测定线粒体内细胞色素C含量。结果表明莳萝子挥发油导致C.albicans出现典型的凋亡特征,如染色质凝集、细胞核浓缩和磷脂酰丝氨酸的外翻,说明莳萝子挥发油导致了C.albicans细胞凋亡。莳萝子挥发油促进C.albicans线粒体内细胞色素C的释放,并激活了Metacaspase。抗氧化剂半胱氨酸抑制挥发油导致的细胞核裂解,磷脂酰丝氨酸的外翻以及Metacaspase的活化,提示活性氧是莳萝子挥发油导致细胞凋亡的重要介质,实验结果表明莳萝子挥发油通过引起C.albicans线粒体活性氧累积,进而激活Metacaspase诱导真菌凋亡,从而发挥其抗真菌作用。